犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及分子流行病学分析

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分类号密级UDC单位代码10435硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及分子流行病学分析EstablishmentandmolecularepidemiologicalanalysisoffluorescencequantitativePCRdetectionmethodforcanineparvovirus研究生姓名姜玮指导教师单虎教授张传美副教授第二导师李舫教授学位种类兽医硕士专业领域2018年6月.中国 QingdaoAgriculturalUniversityTheThesisofProfessionalMasterEstablishmentandmolecularepidemiologicalanalysisoffluorescencequantitativePCRdetectionmethodforcanineparvovirusGraduatewithProfessionalMasterDegree：JiangWeiMentor:Prof.ShanHuProf.ZhangChuanmeiSecondMentor:Prof.LiFangTypeofProfessionalDegree：MasterofVeterinaryMedicineAcademicfield： 学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日 青岛农业大学硕士专业学位论文摘要犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及分子流行病学分析摘要犬细小病毒感染是由犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)引起的一种高度接触性传染病,传播速度快。目前，该病尚无有效的治疗方法，对其防治主要以弱毒疫苗免疫预防为主。由于CPV的主要抗原位点位于VP2蛋白上,因此,VP2基因及其编码蛋白己成为研究犬细小病毒的热点。犬细小病毒从1978年发现以来，由于其变异速率快，宿主范围不断扩大，给其防治增加了困难，严重影响了我国经济动物养殖业的健康发展。从1979-2000年，CPV-2发生了几次重要的基因变异，先后产生了CPV-2a、CPV-2b、NewCPV-2a和NewCPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)以及CPV-2c七种抗原变异株。检测犬细小病毒的方法多种多样，其中普通PCR技术能够快速检测，但存在的不足是不能定量、易产生污染；荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上发展起来的，特异性强、可以进行定量测定等优点，而且能够克服普通PCR的缺点，所以荧光定量PCR广泛应用于各类疾病的诊断。根据GenBank中犬细小病毒VP2蛋白基因序列，选择其保守序列设计引物并构建质粒，对系列稀释的质粒进行扩增构建标准曲线，同时进行特异性试验，重复性试验和敏感性试验。并对临床送检病料进行检测，表明所建立的荧光定量PCR方法具有良好特异性、敏感性和重复性，可用于细小病毒病的病原检测。根据建立的荧光定量PCR检测方法，采集了临床上送检的87个样本进行三种方法对比分析：胶体金检测、普通国际标准PCR检测和荧光定量PCR检测。检测结果表明，胶体金检测出犬细小病毒阳性病例有49例（49/87）；普通国际标准PCR检测犬细小病毒阳性病例有53例（53/87）；荧光定量PCR检测出犬细小病毒阳性病例有59例（59/87）。结果证明荧光定量PCR的检测方法要比胶体金和普通国际标准PCR检测方法的灵敏度更高。对临床有腹泻症状的犬进行VP2基因的扩增和测序比对。结果显示：21株毒株之间的核苷酸的同源性：97.8%～100%；氨基酸同源性为98.2%～99.9%；与国内外CPV参考株之间核苷酸的同源性：95.2%～100%；氨基酸的同源性：96.7%～100%。21株CPV毒株中有5株CPV-2c亚型，5株CPV-2a亚型，其余均为CPV-2b亚型。关键词：犬；细小病毒；荧光定量PCR；VP2基因；基因序列分析 青岛农业大学硕士专业学位论文AbstractEstablishmentandmolecularepidemiologicalanalysisoffluorescencequantitativePCRdetectionmethodforcanineparvovirusAbstractCanineParvovirus(CPV)infectionisakindofseriouscontagioustransmissiondisease,whichiscausedbyCPVandspreadsveryrapidly.Nowadays,thereisnoremedialmethodforitsinfeetion.Clinieally,PreventivemeasuresagainstCPVaremainlydependentonattenuatedvaccine.ThereweremajorepitopesinVP2ProteinofCPV,soseientistsareinterestedinVP2protein.Canineparvovirushasbeenfoundsince1978,itisdifficulttopreventandcontrolduetoitsvariationrateandexpandinghostrange,whichseriouslyaffectedthehealthydevelopmentofeconomicanimalbreedingindustry.From1979-2000years,severalimportantgeneticvariationshaveoccurredinCPV-2,andCPV-2a,CPV-2b,NewCPV-2aandNewCPV-2b,CPV-2c(a)andCPV-2c(a)andsevenkindsofantigenvariantshavebeenproducedsuccessively.Atpresent,thereweremanywaystodetectcanineparvovirus,inwhichthecommonlyusedPCRtechnologycanbequicklydetected,butitisshortofquantitativeonandeasytogeneratepollution.FluorescencequantitativePCRtechnologyisdevelopedonthebasisofcommonPCR,whichhastheadvantagesofstrongspecificityandcanbequantified,andcanovercometheshortcomingsofcommonPCR,sothefluorescencequantitativePCRiswidelyusedinthediagnosisofvariousdiseases.Areal-timePCRmethodwasestablishedtodetectCPV，whichhassensibility，specificityandrepetitiveness.PrimersweredesignedaccordingtoVP2proteingeneofCPVandtherepliconwasinsertedintopMD19-Tvector．Theplasmidsweredilutedseriallyandamplificutedtoestablishthestandardcurve.AllresultsshowedthattheSYBRGreenrealtimePCRestablishedhasbetterspecficity,sensibilityandrepetitiveness．AccordingtothefluorescencequantitativePCRdetectionmethodestablishedbytheexperiment,87sampleswerecollected,andthreemethodswerecomparedandanalyzedforcolloidalgolddetection,commoninternationalstandardPCRdetectionandfluorescencequantitativePCRdetection.Theresultsshowedthat49casesofcanineparvovirusweredetectedbycolloidalgold(49/87),53casesofcanineparvovirus(53/87)weredetectedbyconventionalinternationalstandardPCR,59cases(53/87)were 青岛农业大学硕士专业学位论文AbstractdetectedbyfluorescencequantitativePCR(59/87).TheresultsshowedthatthefluorescencequantitativePCRassayismoresensitivethancolloidalgoldandcommoninternationalstandardPCRdetectionmethods.VP2geneamplificationandsequencingofdiarrheasymptomsindogs.TheresultsindicatedthattheVP2genehomologyofnucleotideandaminoacidwere97.8%～100%and98.2%～99.9%respectivelyamongthis21CPVisolatesinShandongProvince.ComparativeanalysisrevealedthattheCPVisolateshomologyofgenomicsequenceandthededucedaminoacidsequencebetweendomesticandoverseasrepresentativestrainswere95.2%～100%and96.7%～100%.Inthisresearch,5CPV-2asubtypes,5CPV-2csubtypesand11CPV-2bsubtypesweredetected.Keywords:Canine;Parvovirus;Real-timePCR;VP2;Genesequenceanalysis 青岛农业大学硕士专业学位论文目录目录前言.................................................................................................................................................................1文献综述...........................................................................................................................................................21犬细小病毒病原学研究进展......................................................................................................................21.1犬细小病毒.................................................................................................................................................21.2犬细小病毒基因亚型分类........................................................................................................................21.3犬细小病毒的理化特性和血凝性............................................................................................................22犬细小病毒的研究进展..............................................................................................................................32.1流行病学....................................................................................................................................................32.2诊断技术....................................................................................................................................................32.3疫苗研发....................................................................................................................................................42.4防控与治疗................................................................................................................................................43本文研究的目的和意义..............................................................................................................................5试验一犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立.................................................................................61材料与方法...................................................................................................................................................61.1材料............................................................................................................................................................61.2方法............................................................................................................................................................72结果.............................................................................................................................................................122.1PCR扩增..................................................................................................................................................122.2标准曲线的建立.....................................................................................................................................132.3敏感性试验..............................................................................................................................................142.4特异性试验..............................................................................................................................................152.5重复性试验..............................................................................................................................................163讨论.............................................................................................................................................................17试验二犬细小病毒临床样本检测............................................................................................................181材料与方法.................................................................................................................................................181.1材料..........................................................................................................................................................181.2方法..........................................................................................................................................................18 青岛农业大学硕士专业学位论文目录2结果.............................................................................................................................................................192.1临床样品采集记录..................................................................................................................................202.2临床样品检测结果.................................................................................................................................222.3临床样品检测结果统计.........................................................................................................................233讨论.............................................................................................................................................................26试验三犬细小病毒VP2基因序列分析...................................................................................................271材料与方法.................................................................................................................................................271.1材料..........................................................................................................................................................271.2方法..........................................................................................................................................................272结果.............................................................................................................................................................292.1VP2基因PCR检测结果.........................................................................................................................292.2VP2基因分子流行病学调查..................................................................................................................303讨论.............................................................................................................................................................35全文总结.........................................................................................................................................................37参考文献.........................................................................................................................................................38缩略词表.........................................................................................................................................................41导师组意见.....................................................................................................................................................42致谢.................................................................................................................................................................43 青岛农业大学硕士专业学位论文ContentsContentsPreface................................................................................................................................................................1LiteratureReview..............................................................................................................................................21AdvanceinresearchpathogensofCPV.......................................................................................................21.1GeneralsituationofCPV.............................................................................................................................21.2SubtypeclassificationofCPV...................................................................................................................21.3GenomestructureofCPV............................................................................................................................22AdvanceinresearchpathogensofCPVdisease...........................................................................................32.1EpidemiologyofCPVdisease...................................................................................................................32.2DiagnostictechniquesforCPVdisease.......................................................................................................32.3ResearchanddevelopmentofCPVdiseasevaccine.................................................................................42.4PreventionandcontrolandtreatmentofCPVdisease................................................................................43Thepurposeandsignificanceofthisstudy....................................................................................................4ExperimentoneEstablishmentoffluorescencequantitativePCRfordetectionofcanineparvovirus.........61MaterialsandMethods................................................................................................................................61.1Materials......................................................................................................................................................61.2Methods........................................................................................................................................................72Results........................................................................................................................................................122.1PCRproducts...........................................................................................................................................122.2Establishofstandardcurve........................................................................................................................132.3Sensitivitytest............................................................................................................................................142.4Specificitytest............................................................................................................................................152.5Repeatabilitytest........................................................................................................................................163Discussion..................................................................................................................................................17ExperimenttwoDetectionofclinicalsamplesofCPV................................................................................181MaterialsandMethods..............................................................................................................................181.1Materials....................................................................................................................................................18 青岛农业大学硕士专业学位论文Contents1.2Methods......................................................................................................................................................182Results........................................................................................................................................................192.1Collectionandrecordingofclinicalsamples............................................................................................202.2Clinicalsampletestresults........................................................................................................................222.3Statisticalanalysisofclinicalsamples......................................................................................................233Discussion..................................................................................................................................................26ExperimentthreeVP2genemolecularepidemiologyanalysisofCPV....................................................271MaterialsandMethods.................................................................................................................................271.1Materials....................................................................................................................................................271.2Methods......................................................................................................................................................272Results...........................................................................................................................................................292.1PCRdetectionresultsofclinicalsamples.................................................................................................292.2MolecularepidemiologicalinvestigationaboutVP2geneofsamples.....................................................303Discussion.....................................................................................................................................................35Conclusions......................................................................................................................................................37References........................................................................................................................................................38Abbreviations...................................................................................................................................................41Adviceofthetutorgroup.................................................................................................................................42Thank...............................................................................................................................................................43 青岛农业大学硕士专业学位论文前言前言犬细小病毒病(Canineparvovirus，CPV)是一种高度接触性烈性传染病，不同年龄的犬都能成为被侵害的对象。据报道CPV在1978年第一次被发现，犬在所有年龄段的敏感性都高，但是尤其幼犬最高。幼犬会表现出心肌炎，相反年龄大的犬却不容易被感染。成年犬则主要出现出血性肠炎的临床表现[1]。CPV不仅能够引起多种动物都被感染，而且还能够造成人也被感染，所以使许多病毒研究方面的专家都非常关注此病[2]。因为CPV自第一次被发现以后，不断的在进行抗原漂移，而且广泛流传于世界各个国家，使得宿主的范围也在不断的扩大[3,4,5]。犬细小病毒主要侵害肠道黏膜上皮细胞，肠道粪便内的病毒含量最高，分离病毒时可首选患病犬的粪便或肠道里的内容物。患病动物可以通过分泌物排泄将病毒传染给易感动物。在感染病毒侵入的前两天，经血液循环在体内进行复制，随体液循环到达肠黏膜[11]。经过三到五天后会出现病毒血症。常常会在出现明显临床症状开始出现之前排毒。因为细小病毒的传染性很强，会造成严重的经济损失。犬细小病毒病多发生在春季和夏季，本试验通过对VP2基因测序比对，发现青岛地区已经有CPV-2c的存在，实时荧光定量PCR技术是在普通PCR技术的基础上发展起来的，而且一次可检测96个样品，操作简便、迅速，还可以进行定量测定等优点，克服了普通PCR的缺点，所以实时荧光定量PCR被广泛应用于疾病诊断，为犬细小病毒病的预防和治疗提供相应的理论参考依据。1 青岛农业大学硕士专业学位论文文献综述文献综述1犬细小病毒病原学研究进展1.1犬细小病毒CPV是从1980年在我国警犬、军犬中陆续检测出，感染的犬大多是断乳前的幼犬。是目前发现的较小的DNA病毒之一，广泛流传在犬和毛皮动物中，发病率为50%到100%，死亡率为10%到50%，给特种动物养殖和养犬造成了严重的经济威胁[6-10]。国内不同地区CPV分离毒株在297位和324位氨基酸残基分别发生Ser-Ala和Ile-Arg的突变，个别毒株存在370位发生Gln-Arg突变[12-13]，该突变可能会影响CPV的抗原性和宿主范围。最新研究证实CPVVP2300位氨基酸残基在宿主范围决定中起到关键作用，而300位和389位氨基酸则共同决定了细小病毒的毒力[14]。开展了CPV流行毒株与疫苗毒株感染细胞转录组及比较蛋白质组学研究。1.2犬细小病毒基因亚型分类犬细小病毒主要分为两大类蛋白，即非结构蛋白（NSl、NS2）和结构蛋白（VP1、VP2）[16]。其中NS1是多功能基因表达调控蛋白，与细胞的凋亡有关[17]；而结构蛋白VP2的总量占90%-92%之多，VPl却只是占10%-16%，VP3的量就更少之又少了，所以VP2是构成病毒衣壳的主要成分，而且它还具有能自我组装成病毒样颗粒（VLPs）的能力[18]。VP1蛋白比VP2蛋白要大一些，这些序列是互相重叠的，并且是以相同的密码子终止[19]。CPV自从1978年被发现以来就一直在发生变异，1986年以后分离的CPV大部分为新抗原类型CPV-2b，在很大程度上取代了CPV-2a型，据有关报道显示，CPV-2a与之前的CPV-2相比有三个氨基酸发生突变，即第87位Met突变为Leu；第300位Ala突变为Gly和第305位Asp突变为Tyr[20]。1984年CPV-2b被发现，CPV-2b的第426位由ASN突变成ASP[21]。随后，2001年发现第426位的ASP又突变为Glu[22]，后被命名为CPV-2c。426位的N是CPV-2a特有的；而且，CPV-2a和CPV-2b只有第426位氨基酸不同，426位的D是CPV-2b所特有的。1.3犬细小病毒的理化特性和血凝性对高温有一定的耐受力，能耐受65℃30min保持感染性[23]，60℃能存活1h。对低温不敏感，在4℃条件下几年时间仍能保持有感染能力，室温下一般可存活数月，而且不能被乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂溶解，福尔马林消毒剂及紫外线等均可使病毒失活[24]。2 青岛农业大学硕士专业学位论文文献综述犬细小病毒的血液凝固性不受温度和PH值的影响。研究显示：猫、猪[25]的红细胞可以凝集在PH是6.0-7.2和4-25的温度下，并没有与其他动物的红细胞产生凝集反应[26]。2犬细小病毒的研究进展2.1流行病学犬细小病毒宿主范围逐渐在扩大，许多毛皮动物和食肉动物都能被感染，浣熊和黄鼠狼（如水貂）也有自然感染的CPV报告。易感犬通过直接或间接接触病犬感染，污染的餐具，垫草或摄入受污染的食物和饮用水。而且，康复犬的粪便也可以长期带毒，抵抗力差的犬通过直接或间接接触被感染。犬细小病毒病常年发生，不过春季和冬季发病的尤其多一些。引起发病的原因也有很多，常见的有：天气突然变冷或变热、饲养长期不打扫、动物之间拥挤等，犬场里蚊子也可以携带细小病毒。目前，我国流行的犬细小病毒（CanineParvovirus,CPV）主要为CPV-2a/2b型，大部分地区以CPV-2a亚型为主[27]。犬细小病毒通过抗原变异产生新的突变株，断奶后的幼龄犬是最容易感染的，流行严重时，可以在幼犬群中迅速传播。本病主要有两种临床类型：肠炎型[28]和心肌炎型[29]，我国常常见的是肠炎型。亚洲国家流行主要是CPV-2a和CPV-2c型[30]。2.2诊断技术目前用于犬细小病毒的诊断方法有很多，建立了CPV新型原液荧光定量PCR，可区分不同CPV亚型的鉴别荧光定量PCR；新型纳米PCR；实时荧光环介导等温扩增；病毒分离；电镜检查；动物试验；抗原、抗体免疫胶体金检测试纸和间接ELISA抗体检测等简单、快速、准确的检测技术；各种诊断方法的特异性、实用性和敏感性各不相同。在国内外传统免疫学诊断方法的基础上，建立了许多新的免疫学方法，为犬细小病毒病的准确快速诊断提供了有力的保证。这些年对细小病毒的诊断，专家们研发了很多种不同的PCR检测方法。与传统方法相比，其敏感性和特异性毋庸置疑：荧光定量PCR分为两种：探针法和染料法[31,32]。探针法的原理是因为在合成的探针两端有淬灭基团和发光基团，它们都同时存在时，由于荧光猝灭基团的限制，荧光发光基团不发光。但当DNA开始复制时，发光基团和猝灭基团在酶切的作用下被释放，此时淬灭集团就失去了对发光集团的抑制，使发光基团发光，发光集团发出的这些光的信号被机器收集以后进行基因定量；王中力等[35]用三枸橼酸钠与胶体金颗粒的制备、纯化病毒多克隆抗体的硝酸纤维素膜，并做了一个对病毒3 青岛农业大学硕士专业学位论文文献综述抗原的快速检测试验。胶体金检测已成为国内外最常用的CPV检测方法；刘宏伟等[39]发表的用单克隆酶标抗体制成的快速检测试剂盒，已经可以做到在半个小时内就出现判定结果；杨慧等[31]建立的犬细小病毒LAMP快速可视化检测的敏感性是PCR的100倍。2.3疫苗研发针对犬细小病毒病有效的防控办法就是疫苗免疫接种，而用于预防CPV的疫苗主要是弱毒疫苗、灭活疫苗和表位疫苗，但前两者的缺点是：病毒返祖突变，疫苗不好制备和保存，需要多次注射等。与前两者相比，表位疫苗少了疫苗中与免疫无关的成分，免疫产生的抗体特异性更强，更加安全可靠。目前表位疫苗是当前疫苗研究的一个热点，开展了CPVNewCPV-2a/2b型灭活疫苗及多联苗、多表位重组蛋白多联疫苗、病毒样颗粒疫苗、特异性靶向CPV融合DNA疫苗等新型疫苗的研究。疫苗是预防这种疾病的主要措施。部分专家学者认为：犬细小病毒疫苗能够对其产生有效的保护和预防，但另一部分专家学者的观点恰恰与之相反，他们认为接种细小病毒的疫苗所产生的免疫力，只能是抵抗相同亚型的菌株，对于不同亚型的菌株不能产生很好的保护和预防作用。不过随着越来越多的宠物受到主人的重视和关爱，对该病的治愈也会逐渐提高的。2.4防控与治疗犬细小病毒表面无囊膜覆盖，所以CPV具有较强的抗外界干扰能力。CPV对普通消毒剂不敏感，耐受零度低温，患病犬的排泄物中一般情况下会存在350万个病毒粒子，是平均感染剂量的35000[36]。被病犬排泄在外界环境里的病毒粒子一般在一个月内就会失去它的感染性，所以在引入新犬的时候，可以选择先将新引入的犬隔离一个月左右，如果这期间没有发病的，且生长良好时再与其他犬混养在一起。目前对已经被细小病毒污染的场地还没有找到有效的措施来进行彻底的消毒和灭菌[37]，但是实践发现，通过人工来机械的去除病毒的方法是有效的。可以人工借助农药喷雾器来喷洒受污染地区的每个角落，这种效果要更明显一些。治疗这种疾病主要是恢复电解质和体液平衡。只要发现有CPV感染，应该立即采取补液疗法，因为细小病毒能够引起动物出现长时间的腹泻，而长时间的腹泻就会导致动物机体发生脱水和酸中毒。所以为了维持动物机体的电解质平衡，应该先为动物进行补液。疾病早期，使用高免血清可用于减少病毒感染。4 青岛农业大学硕士专业学位论文文献综述3本文研究的目的和意义因为在当下的生活环境下，人们迫于生活的压力，越来越多的人把更多的时间用在工作中而没有办法陪伴老人，分身乏术的无力感，正是在这种原因下，大部分老人会选择宠物犬作为日常伴侣，缓解生活的孤独，这就使得人类接触动物的机会也越来越多。犬细小病毒是危害犬最为严重的传染病之一，一年四季均可发生，不同年龄的犬都能被侵害，康复的犬仍然可以长期向外排毒，健康犬通过直接接触或间接被感染，犬细小病毒是70年代中后期出现的一种单链DNA病毒[38]。目前许多毛皮动物或食肉动物都能被感染，浣熊和黄鼠狼（如水貂）也有自然感染的CPV报告。易感犬通过直接或间接接触病犬感染，污染的餐具，垫草或摄入受污染的食物和饮用水，犬细小病毒造成了严重的经济损失。犬细小病毒自从发现以后，很快发生变异：由CPV-2转变成CPV-2a；然后由CPV-2a转变成CPV-2b；后来又由CPV-2b转变成CPV-2c[39]，所以CPV在DNA病毒中属于高度变异的病毒。对环境耐受能力强和传播速度快。由于CPV的主要抗原位点是在VP2蛋白上，而且VP2的总量占90%-92%，所以VP2蛋白保守区基因为检测的目的基因。因此，VP2基因及其编码的蛋白质成为犬细小病毒病的研究热点。实时荧光定量PCR技术极大地提高了对犬细小病毒病的检测水平，依照GenBank中发表的CPV保守区设计基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物,建立高特异性和高敏感性荧光定量PCR检测方法。5 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立试验一犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立实时荧光定量PCR（探针法）是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，在探针两端分别有淬灭基团和发光基团，它们同时存在的情况下，因为受到荧光猝灭基团的限制，荧光发光基团不发光。但是当DNA开始复制的时候，发光基团和猝灭基团在酶切的作用下被释放，此时淬灭基团就失去了对发光基团的抑制，使发光基团发光，发光基团发出的这些光的信号被机器收集以后进行基因定量。1材料与方法1.1材料1.1.1菌毒株犬细小病毒（CPV)、禽流感病毒（AIV）、猫细小病毒（FPV）、犬腺病毒（CAV）、水貂肠炎病毒（MEV）、犬冠状病毒（CCV)、犬瘟热病毒（CDV）和E．coliDH5a感受态细胞均由本实验室保存。1.1.2主要仪器Roche48011荧光定量PCR仪（德国罗氏公司）；MDF-382E超低温冰箱（松下电器有限公司上海分公司）；微量移液器；heraeusbiofuge15r型台式高速冷冻离心机；水浴锅（龙口先科仪器有限公司）；BSC-1100-LIIA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；K8360型全自动凝胶成像系统(北京科创锐新生物科技有限公司)；T100型PCR仪（BioRad公司）。1.1.3分子生物学试剂Premix试剂、pClone007载体和DNA凝胶回收试剂盒均购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司；质粒小量提取试剂盒和氨苄青霉素购自TaKaRa宝生物（大连）公司；DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA-MarkerDL-2000；rTaqDNA聚合酶(5U/uL)等。1.1.4主要试剂的配制（1）LB固体培养基：用电子天平称取40gLB营养琼脂溶解于干净的1000ml蒸馏水中，搅拌混匀，121℃高压灭菌15分钟后，倒入灭菌后的培养皿中，倒置，凝固后，4℃保存备用。（2）LB液体培养基：用电子天平称取25gLB肉汤溶解于干净的1000ml蒸馏水中，6 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立搅拌混匀后，121℃高压灭菌15min后，分装至10ml灭菌的离心管内，放置冰箱4℃内保存，备用。（3）LB固体培养基（含Amp+）：用（1）中的方法再另外配置一份LB固体培养基，仍是在121℃高压灭菌15分钟的条件下灭菌后，冷却后，切忌要在LB固体培养基凝固之前，向其中加入1mL的Ampicillin贮存液混匀，倒入灭菌后的培养皿中，倒置，凝固后用封口膜将培养基封好后，至于4℃冰箱保存备用。（4）LB液体培养基（含Amp+）：用（2）中的方法再另外配置一份LB液体培养基，也是在121℃高压灭菌15分钟的条件下灭菌后，稍微冷却之后向其中加入1mL的Ampicillin贮存液混匀，分装到提前灭好菌的10ml的离心管里，用封口膜将离心管口封好后，至于4℃冰箱保存备用。1.2方法1.2.1引物设计与合成按照GenBank中已经发表的CPVVP2基因序列，设计引物(见表1-1），CPVSHORTF/R和探针由TaKaRa宝生物（大连）公司合成。表1-1引物序列Table1-1Sequenceoftheprimers引物上游引物（5’3’）下游引物（5’3’）CPVSHORTAGTATCAAATTCTTTATCCCAAACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATCPVSHORTPFAM-TGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCA-BHQ11.2.2DNA/RNA提取依照TIANGEN公司的DNA/RNA提取试剂盒的说明书进行提取核酸：（1）取出试剂盒内ProteinaseK，取20µl加入离心管内，然后向离心管中加入处理好以后的200µl的待检病毒悬液；加入事先按说明书配置好的工作液200µl，上下颠倒或用涡旋振荡仪震荡15s左右，确保加入的样品与试剂充分混匀。（2）将充分混匀后的样品，放在56℃水浴锅里孵育15min左右，孵育好后向离心管内加入无水乙醇250µl，这个时候会出现絮状物的沉淀，用涡旋振荡仪涡旋振荡15s左右，使其彻底混匀以后，置于室温静置5min。（3）静置5min以后，将离心管里所有的溶液和类似絮状物全部移至试剂盒内的吸附柱CR2里，离心（离心机设置为：8000rpm1min）倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。（4）向吸附柱中加入500µl的GD溶液，依旧是8000rpm1min，倒掉废液,将吸附柱7 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立重新放回收集管；再向吸附柱中加入600µl的PW溶液，静置2min，然后8000rpm1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管后，再重复PW溶液操作一次。（5）此时再向吸附柱内加入500µl的无水乙醇，8000rpm1min倒掉离心下来的液体以后，再将吸附柱放回收集管中，此时空柱12000rpm3min，目的是为了使吸附膜能够完全变干。（6）最后把吸附柱重新放到试剂盒内的RNase-Free离心管中，打开盖子，室温静置3min，再向膜中央悬空滴加25µlRNase-FreeddH2O（或者双蒸水），静置5min，12000rpm1min，离心得到的就是样本DNA。1.2.3反转录表1-2反转录体系Table1-2Reversetranscriptionalsystem组分体积5×ExTaqBuffer4.0µLdNTPMixture(2.5mM)2.0µLm-MLVRT0.5µLRRI0.5µL上游引物(20µmol/L)0.5µL下游引物(20µmol/L)0.5µLRNA模板5.0µLDEPC7.0µL总体积20µL42℃1h，然后72℃10min；-20℃备用或-70℃保存。1.2.4PCR扩增25µL的反应体系（见表1-3）表1-3PCR反应体系Table1-3PCRMixtureforamplificationofDNAfragments组分体积ddH2O9.5µLHighfidelitymastermix12.5µLCPVF(20µmol/L)0.5µLCPVR(20µmol/L)0.5µLDNA模板2.0µL总体积25.0µL8 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立反应条件：预变性94℃2min变性94℃40s退火55℃30s35个循环延伸72℃40s终延伸72℃3min1.2.5PCR产物凝胶电泳用电子天平称取2g琼脂溶于1×TAE缓冲液中，待琼脂糖加热溶化后，加入1µlGoldView(GV)混匀。凝固后制成凝胶板。用移液器移取5µLPCR产物与1µL的6×Loadingbuffer混合均匀后，加入到凝固好的琼脂糖凝胶孔中，加入6µLDNAMarkerDL-1000，用ddH2O作阴性对照。120v电压进行电泳，28min后，于凝胶成像仪下观察并记录电泳结果。1.2.6胶回收纯化PCR产物（1）在吸附柱EC中，加入250µLBufferBL，12000g离心1min，活化硅胶膜。（2）将上述电泳中检测出的目的条带，置于紫外灯下用刀片将DNA条带切下（切记：要尽量去除不含有DNA的多余的凝胶）。将切下的DNA条带的凝胶放入2ml离心管中，加入500µL的BufferGL。65℃水浴放置4-6min，每2-3min上下颠倒混匀一次，至凝胶完全熔化，溶液呈淡黄色。将溶液转入吸附柱EC中，12000g离心1min，弃废液。（3）在吸附柱EC中加入700µLBufferW2，12000g1min，然后再重复操作一次，倒掉废液。空柱12000g离心2min。（4）将离心后的吸附柱放入事先准备好的灭菌离心管中，室温下静置2min，向膜中央加Eluent35µL，静置2min，12000g离心2min。离心后得的DNA溶液即为切下的目的DNA条带，然后可以直接拿来用于之后试验。1.2.7目的基因与T载体的连接将胶回收后的目的基因片段按10µL的反应体系与pClone007载体连接，操作过程按试剂盒（pClone007VectorKit，北京擎科新业生物技术有限公司）说明进行（见表1-4），该试剂盒的特点在于1min就可以连接，不需要过夜连接。9 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立表1-4目的基因片段和pClone007载体连接体系Table1-4TargetgenefragmentandpClone007vectorconnectionsystem组分体积pClone007vector1.0µL10×TopoMix1.0µLPCR产物6.0µLddH2O2.0µL总体积10.0µL注意：室温（22-30℃）下，反应1-5min就可以，操作时不要在冰上。1.2.8连接产物转化连接产物转化试验操作步骤如下：（1）取100µL冰浴上溶化的DH5α感受态细胞，加入10µL连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min。（2）42℃水浴热激30-45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。（3）向离心管中加入500µLSOC培养液，混匀后37℃，200rpm复苏1h。（4）将培养物3000rpm离心5min，弃去上清300µL，留下100µL。(5)剩余培养液和细胞沉淀轻轻吹打混匀，均匀涂布于Amp+LB琼脂平板上。（6）将平皿倒置放于培养箱内，37℃培养12～14h。（7）挑取分布均匀的单个白色菌落，接种到加有Amp+的液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜。1.2.9重组质粒的小量提取使用前需先确认SolutionⅠ中是否加入了RNaseA；BufferWB中是否加入了无水乙醇。（1）取4ml菌液置于离心管内，离心机：12000rpm2min，倒掉上清。向离心管内加入试剂盒内的SolutionⅠ250µL，可以使用振荡器使细菌沉淀充分悬浮。然后加入试剂盒内的SolutionⅡ同样是250µL，上下左右轻轻颠倒混匀几次，形成透明的溶液。混合时不可剧烈振荡，不宜超过5分钟。（2）加入提前4℃预冷的SolutionⅢ350µL，翻转直到形成紧实的凝集块，静置2min，离心机12000rpm10min。将SpinColumn安置于CollectionTube上，将上清液转移至SpinColumn中，12000rpm1min，弃滤液。向吸附柱中加入500µL的BufferWA，12000rpm离心30s，弃滤液。向吸附柱中加入700µL的BufferWB，12000rpm30s，弃滤液；重复操作一次。空柱12000rpm1min，尽量去除残留的洗液。（3）将吸附柱放到一个灭菌的离心管上，向吸附柱的膜中央加入25µL的灭菌蒸馏10 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立水，静置1min，离心机12000rpm1min洗脱DNA，达到小量提取DNA重组质粒的目的。1.2.10重组质粒的PCR鉴定及测序重组质粒PCR鉴定体系（见表1-5）。表1-5重组质粒PCR反应体系（25µL）Table1-5PCRMixtureforamplificationwithrecombinantplasmid组分体积ddH2O9.5µLHighfidelitymastermix12.5µLF(10µmol/L)0.5µLR(10µmol/L)0.5µL重组质粒2.0µL总体积25.0µL反应条件：预变性95℃2min变性94℃40s退火55℃30s35个循环延伸72℃40s终延伸72℃3min将PCR鉴定为阳性的重组质粒送往青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序鉴定。1.2.11重组阳性质粒DNA浓度的测定质粒经核酸蛋白仪分析浓度为47ng/µL，OD260nm/OD280nm为1.90。拷贝数=质粒浓度×阿伏伽德罗常数/（一个碱基对的平均分子量×质粒的总长度）即copies/µL=(6.02×1023)×(ng/µL×10-9)/(DNAlength×660)计算质粒的拷贝数得出质粒浓度为：2.14×1010拷贝/µL。1.2.12标准品制备利用核酸蛋白仪分析测定重组质粒浓度，按101-1010倍比稀释配制体系，制备荧光定量PCR的标准品。1.2.13荧光定量PCR检测方法的建立对SHORT探针法荧光定量PCR的退火温度进行筛选优化。在其他条件保持不变的情况下，将退火温度分别设置为50℃、51℃、52℃、53℃四个梯度，最终得到最佳退火温度为50℃。11 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立表1-6荧光定量PCR反应体系（20µL）Table1-6FluorescencequantitativePCRreactionsystem组分体积ddH2O6.5µLSHORTPremix10.0µLSHORT-F(20µmol/L)0.5µLSHORT-R(20µmol/L)0.5µLSHORT探针0.5µLDNA模板2.0µL总体积20.0µL采用20µL的反应体系，荧光定量PCR反应条件：94℃120s；94℃5s、50℃30s、72℃40s、5个循环；95℃10s、60℃30s40个循环；37℃60s。1.2.14标准曲线的建立分别以2.14×109、2.14×108、2.14×107、2.14×106、2.14×105、2.14×104拷贝6个梯度作为标准品模板进行荧光定量PCR扩增，得出动力学曲线，利用仪器软件自动生成标准曲线。1.2.15敏感性试验分别以2.14×109、2.14×108、2.14×107、2.14×106、2.14×105、2.14×104、2.14×103、2.14×102、2.14×101拷贝的标准品作为模板，荧光定量PCR扩增可得到阳性结果的最小稀释拷贝数，同时用常规PCR对每个稀释度的标准样品进行检测，比较两种方法的敏感性。1.2.16特异性试验以犬细小病毒（CPV)、猫细小病毒（FPV）、水貂肠炎病毒（MEV）、犬冠状病毒（CCV)、犬瘟热病毒（CDV）、禽流感病毒（AIV）、犬腺病毒（CAV）、所抽提的DNA/cDNA为模板进行SHORT探针荧光定量PCR检测，以确定该方法的特异性。1.2.17重复性试验选择2.14×108、2.14×107、2.14×106、2.14×105、2.14×104、2.14×103拷贝的质粒样本，每个稀释度一次进行3个重复。同时，对上述样品进行荧光定量PCR扩增，根据每个稀释度的CT值的进行变异系数计算，确定该方法重复性。2结果2.1PCR扩增对提取的CPV阳性样本进行PCR扩增，CPV扩增出约100bp的DNA片段，与预期的86bp一致（见图1-1）。将鉴定为阳性的质粒进行序列测定，测定结果显示与目的片12 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立段序列一致，可以用其作为CPVDNA模板进行荧光定量PCR。M1234561000bp750bp500bp100bp86bpM：DNAMarkerDL-1000；1-5：CPV样品；6：阴性对照M：DNAMarkerDL-1000；1-5：CPVsamples；6：Negativecontrol图1-1PCR扩增结果Fig.1-1PCRproductsofCPVVP2genome2.2标准曲线的建立分别选择2.14×109、2.14×108、2.14×107、2.14×106、2.14×105、2.14×104拷贝6个梯度怍为标准品模板，制作标准曲线（见图1-2）。标准曲线斜率为-3.2797，轴截距为26.111，线性方程为Y=-3.2797x+26.111，相关系数R2=0.9991，表明线性很好。从左至右依次为1：2.14×109；2：2.14×108；3：2.14×107；4：2.14×106；5：2.14×105；6：2.14×104拷贝/μLKineticscurvesofthestandardsformlefttoright1：2.14×109；2：2.14×108；3：2.14×107；4：2.14×106；5：2.14×105；6：2.14×104copies/μL13 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立图1-2荧光定量PCR的标准曲线Fig.1-2StandardcurveoffluorescencequantitativePCR2.3敏感性试验在制作标准曲线的过程中，模板的初始数越低，CT值越大。一般认为，CT值大于35时，定量结果被认为是不准确的。试验结果显示，荧光定量PCR能检测出的模板最低浓度为2.14×101拷贝/µL（见图1-3），常规PCR能检出最低模板浓度为2.14×104拷贝/µL（见图1-4），这表明荧光定量PCR的灵敏度是常规PCR的1000倍。从左至右依次为1:2.14×109；2:2.14×108；3:2.14×107；4:2.14×106；5:2.14×105；6:2.14×104;7:2.14×103；8:2.14×102；9:2.14×101拷贝/μLKineticscurvesofthestandardsformlefttoright1:2.14×109；2:2.14×108；3:2.14×107；4:2.14×106；5:2.14×105；6:2.14×104;7:2.14×103；8:2.14×102；9:2.14×101copies/μL图1-3荧光定量PCR敏感性试验Fig.1-3FluorescencequantitativePCRsensitivitytes14 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立M1234t56781000bp750bp500bp100bp86bp从左至右依次为1:2.14×109；2:2.14×108；3:2.14×107；4:2.14×106；5:2.14×105；6:2.14×104;7:2.14×103拷贝/μL；8:阴性对照Kineticscurvesofthestandardsformlefttoright1:2.14×109；2:2.14×108；3:2.14×107；4:2.14×106；5:2.14×105；6:2.14×104;7:2.14×103copies/μL；8：negtivecontrol图1-4常规PCR灵敏性测验Fig.1-4DetectingsensitivityofroutinePCR2.4特异性试验图1-5荧光定量PCR特异性检测Fig.1-5DetectingspecificityofFQ-PCR图1-5结果表明，犬细小病毒（CPV)、犬冠状病毒（CCV)、犬瘟热病毒（CDV）、禽流感病毒（AIV）和犬腺病毒（CAV）中只检测到犬细小病毒。15 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立1:犬细小病毒（CPV）；2:水貂肠炎病毒（MEV）；3:猫细小病毒（FPV）；图1-6荧光定量PCR特异性检测Fig.1-6DetectingspecificityofFQ-PCR图1-6结果表明，犬细小病毒（CPV)、水貂肠炎病毒（MEV）、猫细小病毒（FPV）、犬冠状病毒（CCV)、犬瘟热病毒（CDV）和禽流感病毒（AIV）中，检测到CPV、MEV和FPV，说明该方法可以特异性的检测出细小病毒。2.5重复性试验为了验证荧光定量PCR检测结果的重复性，以20µL体系连续扩增3次，试验结果显示，每个样本的重复性都很好（如图1-7），说明该方法具有较好的重复性和稳定性。1：2.14×108；2：2.14×107；3：2.14×106；4：2.14×105；5：2.14×104；6：2.14×103拷贝/μL；1：2.14×108；2：2.14×107；3：2.14×106；4：2.14×105；5：2.14×104；6：2.14×103copies/μL；图1-7FQ-PCR重复性试验Fig.1-7RepeatabilitytestsofFQ-PCR16 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立表1-7样品的重复性检查结果Table1-7DetectingrepeatabilityofFQ-PCRCT值平均拷贝数CT标准差变异系数(CV)123CT值2.14×10810.9711.0211.1511.060.090.81%2.14×10713.9914.0314.2514.120.130.92%2.14×10619.6719.7320.1719.920.251.26%2.14×10523.5323.7124.2323.880.351.46%2.14×10427.3327.8928.2327.780.451.61%2.14×10330.8631.5131.9831.420.561.78%由表1-7可以看出，3次检测的CT值变异系数均少于2.0%（见表1-7）3讨论通过试验结果可知，本试验方法检测不出其他结构病毒，可以特异性的检测出细小病毒。它可以检测PCR过程中荧光信号的变化，从而得到定量的结果[40-42]。而且是在完全封闭的体系中完成扩增，既实现了实时监测，又消除了交叉污染，荧光定量PCR不需要凝胶电泳看结果，因此在很多领域得以应用[43]。例如：荧光定量PCR技术广泛地应用于分子生物学的各个研究领域。涉及到的范围包括病原体的检测(细菌、病毒、真菌等)、等位基因的鉴定(单核苷酸多态性的检测)和基因表达的定量(生长因子、细胞因子、转录因子等)等多个领域[44]。本试验通过GenBank根据CPVVP2基因的保守区来设计引物，经过BLAST分析，引物特异性好，建立的荧光定量PCR检测方法可用于细小病毒的扩增鉴定。因为用于分离的病料首选的是感染动物的肠内容物或粪便，许多物质会对所提取的DNA质量造成很大的干扰，极容易造成假阳性，从而影响PCR反应结果的准确性。荧光定量PCR灵敏度和扩增效率更高，对样品处理要求较低。犬细小病毒荧光定量检测方法已有报道，刘海防等[45]采用TaqMan探针法检测CPV，最低可检测10拷贝/µL模板；李英俊等[46]建立了荧光定量PCR方法可以检测到102个拷贝，而且有报道显示曹雪峰等[47]目前已经建立一种不需要提取病毒的DNA，可以直接采用样本上清液检测犬细小病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。本文所建立的SHORT探针PCR方法最低达到21.4拷贝/µL，重复性好，可应用于临床检测。17 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测试验二犬细小病毒临床样本检测根据试验一所建立的荧光定量PCR检测方法，采集了临床上有腹泻症状的样品87例，分别进行胶体金检测、普通国际标准PCR检测和荧光定量PCR检测方法进行对比分析。1材料与方法1.1材料1.1.1主要仪器MDF-382E超低温冰箱（松下电器有限公司上海分公司）；微量移液器；水浴锅（龙口先科仪器有限公司）；BSC-1100-LIIA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；T100型PCR仪（BioRad公司）；K8360型全自动凝胶成像系统(北京科创锐新生物科技有限公司)和电泳仪等。1.1.2主要试剂DNAisoRegent、DNA-MarkerDL-1000、DL-2000、6×LoadingBuffer、GoldView、rTaqDNA聚合酶(5U/µL)和50×TAE缓冲液等均为大连宝生物工程有限公司产品。1.2方法1.2.1引物本试验中CPV国家标准引物是引用单虎[48]等人起草并通过的犬细小病毒病诊断技术中华人民共和国国家标准中的引物，目的片段559bp（见表2-1），荧光定量PCR引物和探针使用的是试验一中设计合成的。国家标准引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。表2-1引物序列Table2-1Sequenceoftheprimers引物上游引物（5’3’）下游引物（5’3’）CPVGBGAATCTGCTACTCAGCCACCAACGTGCACTATAACCAACCTCAGC1.2.2PBS缓冲液的配制用电子天平分别称取8.0g氯化钠（NaCl）、0.24g磷酸二氢钾（KH2PO4）、1.44g磷酸氢二钠（Na2HPO4）和0.2g氯化钾（KCl），加入900mL的蒸馏水中，搅拌溶解后，用蒸馏水定容到1000mL，121℃15min,然后置于4℃冰箱保存备用。18 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测1.2.3临床样品采集采集2017年全年来自青岛市宠物医院的有腹泻症状的87个临床样品，其中样品包括粪便、肠内容物、口鼻分泌物等。粪便样品采集：外观异常的粪便应挑取有脓血、粘液的部分；外观无异常的粪便应该从粪便中央挑取。肛门拭子采集：以灭菌棉拭子从肛门深处或泄殖腔黏膜上蘸取粪便，并立即放入灭菌的装有PBS缓冲液试管内。1.2.4DNA提取样品DNA提取依照TIANGEN公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂说明书提取样品的核酸。具体方法步骤参照试验一中1.2.2的方法。1.2.5CPV国标引物PCR扩增25µL的反应体系（见表2-2）表2-2PCR反应体系Table2-2PCRMixtureforamplificationofDNAfragments组分体积ddH2O9.5µLHighfidelitymastermix12.5µLCPVF(20µmol/L)0.5µLCPVR(20µmol/L)0.5µLDNA模板2.0µL总体积25.0µL反应条件：预变性94℃2min变性94℃40s退火55℃30s35个循环延伸72℃40s终延伸72℃3min1.2.6PCR产物凝胶电泳用电子天平称取2g琼脂溶于1×TAE缓冲液中，待琼脂糖加热溶化后，加入1µLGoldView(GV)混匀。凝固后制成凝胶板。用移液器移取5µLPCR产物与1µL的6×Loadingbuffer混合均匀后，加入到凝固好的琼脂糖凝胶孔中，加入6µLDNAMarkerDL-1000，用ddH2O作阴性对照。120v电压进行电泳28min，于凝胶成像仪下观察并记录电泳结果。19 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测2结果2.1临床样品采集记录采集了87个有腹泻症状的临床样本进行编号、统计、归纳（如表2-3）表2-3临床病例统计Table2-3Statisticsoftheclinicalcase编号种类性别样品来源免疫情况01泰迪公肛门拭子未免疫02哈士奇公呕吐物未免疫03金毛公呕吐物免疫不完全04京巴公呕吐物、稀便未免疫05泰迪母稀便未免疫06金毛公稀便未免疫07博美母肛门拭子未免疫08泰迪公稀便未免疫09萨摩母肛门拭子免疫不完全10金毛公稀便免疫11金毛公稀便未免疫12哈士奇母血便免疫不完全13巴哥母血便、呕吐物免疫不完全14泰迪公稀便、呕吐物免疫不完全15金毛母稀便免疫不完全16松狮公肛门拭子免疫不完全17泰迪公血便免疫18金毛公肛门拭子免疫19约克夏母肛门拭子未免疫20德牧母粪便未免疫21泰迪公呕吐物免疫不完全22田园犬母肛门拭子免疫23哈士奇母稀便、呕吐物免疫24哈士奇母粪便免疫25金毛母肛门拭子未免疫26金毛母肛门拭子未免疫27哈士奇公呕吐物免疫不完全28萨摩母稀便免疫29金毛公稀便免疫30博美公稀便免疫31泰迪公稀便免疫不完全32贵宾公粪便免疫20 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测33边牧母呕吐物免疫34田园犬公稀便免疫不完全35博美母肛门拭子免疫36金毛母肛门拭子免疫37金毛公肛门拭子免疫38约克夏公肛门拭子免疫39巴哥公肛门拭子免疫不完全40金毛公呕吐物免疫不完全41泰迪母呕吐物未免疫42萨摩母粪便免疫43泰迪公肛门拭子免疫不完全44田园犬母稀便未免疫45萨摩公肛门拭子免疫46藏獒母粪便未免疫47博美公肛门拭子免疫不完全48泰迪公呕吐物未免疫49金毛母肛门拭子免疫50田园犬公肛门拭子未免疫51吉娃娃公稀便免疫不完全52博美母肛门拭子免疫不完全53斗牛母稀便免疫54萨摩母粪便未免疫55金毛母粪便未免疫56比熊公肛门拭子未免疫57金毛母粪便免疫58边牧母粪便免疫59金毛公肛门拭子免疫不完全60泰迪公肛门拭子免疫61泰迪母肛门拭子免疫62萨摩母肛门拭子免疫63萨摩公呕吐物免疫不完全64松狮公肛门拭子免疫65泰迪公肛门拭子免疫不完全66巴哥母稀便免疫不完全67巴哥公肛门拭子免疫不完全68约克夏母肛门拭子未免疫69博美母呕吐物未免疫70金毛母肛门拭子未免疫71金毛母肛门拭子免疫不完全72博美母粪便未免疫73博美公粪便未免疫74金毛公粪便未免疫75金毛公呕吐物未免疫21 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测76泰迪母肛门拭子免疫不完全77田园犬母肛门拭子免疫78泰迪公肛门拭子未免疫79田园犬母稀便免疫80德牧母肛门拭子免疫不完全81松狮公呕吐物未免疫82泰迪母肛门拭子未免疫83比熊公肛门拭子未免疫84泰迪母呕吐物、血便未免疫85德牧公肛门拭子免疫86斗牛公肛门拭子免疫87柯基公呕吐物免疫2.2临床样品检测结果2.2.1胶体金检测胶体金试纸条用的是犬细小和犬冠状二联胶体金检测试纸（GenbodyInc）。首先将试纸从包装袋中取出，将采取的临床样本稀释后，静置取上清。滴加至试纸的反应样品孔中，稍等片刻，对照出现的红色条带，读取结果（见图2-1）。图2-1CPV胶体金检测结果Fig.2-1Detectionresultsofcolloidalgold22 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测2.2.2国家标准PCR检测12345678910M111000bp750bp559bp500bp100bp1～10：临床样品；11：阴性对照；M：DNAMarkerDL-10001～10：Clinicalsamples；11：Negativecontrol；M：DNAMarkerDL-1000图2-2CPVPCR扩增结果Fig.2-2PCRproductsofCPVgenome由图2-2的电泳结果可以看出，1-10号样本目的条带为559bp，符合预期产物片段的大小，可以确定为是犬细小病毒。2.2.3荧光定量PCR检测图2-3临床病例荧光定量PCR检测结果Fig.2-3DetectionofclinicalsamplesinFQ-PCR用试验一建立的SHORT探针荧光定量PCR检测方法抽取临床上87个有腹泻症状样本的其中42个样品DNA，结果（如图2-3）显示，病毒含量与CT值呈反比，即细小病毒的含量越高，CT值就越低。2.3临床样品检测结果统计对上述临床疑似患病犬进行胶体金检测、国际标准PCR检测和荧光定量PCR检测23 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测结果进行统计(如表1-6）。结果显示：其中用胶体金试纸板检测的临床疑似CPV病例中，阳性率约为56.3%（49/87）；用国际标准PCR检测病例中，阳性率约为60.9%（53/87）；用荧光定量PCR检测病例中，阳性率约为67.8%（59/87）。表1-6临床检测结果统计Table1-6Statisticsofclinicaltestresults编号胶体金试纸板国标PCR荧光定量PCR其他01-++02---CCV03+++04---05+++06+++07---08+++CCV09++-10---11+++12--+CCV13+++14+++15+++16+++17+++18+++19+++20---21+++22+++CCV23+++24+++25+++26---27--+28+++29---30+-+CCV31+-+32---33---34+++24 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测35---36---CCV37+-+38---39+++40+-+41-++42---43---44+++45---CCV46+++47+-+48+++49-++50+++51+++52-++53---54+++CCV55+++56+++57+++58+++59+++CCV60-++61+++62+--63-++64+++65-++66---67+++68---69---70+++71---72+++CCV73---74+++75+++76+++77---25 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒临床样本检测78+++79---CCV80-++81+++82---83---84+++85---CCV86-++87-++3讨论通过上述试验结果可以看出，荧光定量PCR的检测方法要比胶体金和普通PCR的检测方法灵敏度更高，特异性也要更强。但是，临床上对CPV的检测主要还是依靠胶体金试纸条，因为它可以在几分钟内就检测出并可以通过肉眼观察到显色结果，但是试纸条有假阳性或低灵敏度的现象。因为胶体金试纸在缓冲溶液中进行了粪便、呕吐物等简单处理，存在大量杂质和细菌，这就会对结果产生影响。PCR检测方法与胶体金检测方法相比，灵敏度肯定是更高的[49]。普通PCR具有特异性高、重复性好等优点。PCR是针对特定DNA片段放大扩增的分子生物学技术，PCR利用高温变性使其变成单链；低温时引物与单链按照碱基互补配对原则结合以及最适温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行。但是普通PCR也是存在有假阳性和假阴性的结果，而且不一定得到的就是目的片断，电泳鉴定结果时，会发现有的时候有，有的时候没有，或者隔一段时间可能又没有结果，对客观条件要求比较高，所以需要多次摸索条件反复操作，对操作者要求熟练。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号实时积累整个PCR过程，最后用标准曲线进行定量分析未知模板的方法。荧光定量PCR不仅简化了试验操作过程，而且还真正做到了实现绝对定量。而且荧光定量PCR提高了工作效率，可以一次检测96个样本，重复性好、灵敏度高、特异性强、对于含量极少的DNA也能检测出；操作简单，不需要像普通PCR一样再进行电泳，可以直接通过峰图，看到结果，大大缩短了试验的时间。26 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析试验三犬细小病毒VP2基因序列分析犬细小病毒的核衣壳由不同组合的VP1、VP2、VP3共60个亚单位组成，VP2是主要的结构蛋白占总量的90%，编码主要的抗原决定簇；犬细小病毒自从1978年被发现以来就不断的发生变异，先后出现了CPV-2a、CPV-2b、新CPV-2a、新CPV-2b、和CPV-2c等变异毒株[50-53]，其中，CPV-2c于2010年在吉林省被首次报道[54]。本试验对于青岛市动物医院临床样品检测中也出现了CPV-2c基因型。对VP2基因序列分析发现，5株CPV-2c在相同位点发生突变，11株CPV-2b也在相同的位点发生了突变。1材料与方法1.1材料1.1.1主要仪器MDF-382E超低温冰箱（松下电器有限公司上海分公司）；微量移液器；水浴锅（龙口先科仪器有限公司）；DYY-Ⅲ-8B电泳仪（北京市六一仪器厂）；BSC-1100-LIIA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；T100型PCR仪（BioRad公司）；K8360型全自动凝胶成像系统(北京科创锐新生物科技有限公司)和电泳仪等。1.1.2主要试剂DNAisoRegent、DNA-MarkerDL-1000、DL-2000、6×LoadingBuffer、GoldView、rTaqDNA聚合酶(5U/µL)和50×TAE缓冲液等均为大连宝生物工程有限公司产品。1.1.3分子生物学软件DNAStar7.1软件包（EditSeq，Primer5，Protean，MegAlign5.02等）。1.2方法1.2.1引物设计与合成CPVVP2基因组序列是根据GenBank中已经发表的，设计引物CPVVP2-F/R目的片段1755bp（见表3-1），引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。表3-1引物序列Table3-1Sequenceoftheprimers引物上游引物（5’3’）下游引物（5’3’）CPVVP2ATGAGTGATGGAGCAGTTCTTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGT27 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析1.2.2DNA提取依照TIANGEN公司的DNA/RNA提取试剂盒的说明书进行提取核酸：（1）取出试剂盒内ProteinaseK，取20µl加入离心管内，然后向离心管中加入处理好以后的200µl的待检病毒悬液；加入事先按说明书配置好的工作液200µl，上下颠倒或用涡旋振荡仪震荡15s左右，确保加入的样品与试剂充分混匀。（2）将充分混匀后的样品，放在56℃水浴锅里孵育15min左右，孵育好后向离心管内加入无水乙醇250µl，这个时候会出现絮状物的沉淀，用涡旋振荡仪涡旋振荡15s左右，使其彻底混匀以后，置于室温静置5min。（3）静置5min以后，将离心管里所有的溶液和类似絮状物全部移至试剂盒内的吸附柱CR2里，离心（离心机设置为：8000rpm1min）倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。（4）向吸附柱中加入500µl的GD溶液，依旧是8000rpm1min，倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管；再向吸附柱中加入600µl的PW溶液，静置2min，然后8000rpm1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管后，再重复PW溶液操作一次。（5）此时再向吸附柱内加入500µl的无水乙醇，8000rpm1min倒掉离心下来的液体以后，再将吸附柱放回收集管中，此时空柱12000rpm3min，目的是为了使吸附膜能够完全变干。（6）最后把吸附柱重新放到试剂盒内的RNase-Free离心管中，打开盖子，室温静置3min，再向膜中央悬空滴加25µl的RNase-FreeddH2O（或者双蒸水），静置5min，12000rpm1min，离心得到的就是样本DNA。1.2.3PCRVP2扩增表3-2PCR反应体系Table3-2PCRMixtureforamplificationofDNAfragments组分体积ddH2O9.5µLHighfidelitymastermix12.5µLCPVVP2-F(20µmol/L)0.5µLCPVVP2-R(20µmol/L)0.5µLDNA模板2.0µL总体积25.0µL28 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析反应条件：预变性95℃5min变性94℃40s退火51℃50s35个循环延伸72℃2min终延伸72℃10min1.2.4PCR产物凝胶电泳用电子天平称取2g琼脂溶于1×TAE缓冲液中，待琼脂糖加热溶化后，加入1µLGoldView(GV)混匀。凝固后制成凝胶板。用移液器移取5µLPCR产物与1µL的6×Loadingbuffer混合均匀后，加入到凝固好的琼脂糖凝胶孔中，加入6µLDNAMarkerDL-1000，用ddH2O作阴性对照。120v电压进行电泳，28min后，于凝胶成像仪下观察并记录电泳结果。1.2.5测序分析将电泳结果为阳性的PCR产物交由青岛擎科公司测序，从正反两个方向测通比对后进行序列拼接。将测定的CPVVP2基因序列与GenBank中已有的参考毒株序列进行比较（见表3-3）。用DNAStar软件对所获得的VP2基因序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比对分析并绘制系统进化树。表3-3参考毒株序列一览表Table3-3Isolatesusedinthisstudy毒株名称登录号分离地年份种属CPV-2aJQ686671广西2011CanineCPV-2bwuhan2KC881278.1武汉2013CanineCPV-2cBeijingKT162014.1北京2016CanineCPV-2cJilinGU380305.1吉林2010CanineCPV-LZ1JQ268283甘肃2012CanineGZ0201GU569944长春2010CanineLCPVV139AB054222日本2001CanineLCPVV203AB054224日本2001CaninePbrtuguese-2cKR559894葡萄牙2015CanineVac1GQ169552吉林2009Canine2结果2.1VP2基因PCR检测结果琼脂糖电泳显示，该方法能从感染CPV的样品组织中扩增出约1800bp的DNA片段，与预期的1755bp一致（见图3-1）。29 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析12345678M1755bp2000bpbp1000bp750bp500bp250bp100bp1～7：临床样品；8：阴性对照；M：DNAMarkerDL-20001～7：Clinicalsamples；8：Negativecontrol；M：DNAMarkerDL-2000图3-1CPVPCR扩增结果Fig.3-1PCRproductsofCPVgenome2.2VP2基因分子流行病学调查2.2.1VP2基因测序结果及同源性分析通过对随机选出的21株CPV样品进行测序，测得的序列全长1755bp。根据VP2核苷酸序列推导出了相应的584个氨基酸序列。应用DNAStar序列分析软件对所测的VP2序列与GenBank收录的国内外CPVVP2毒株进行同源性比较。结果表明，21株CPV毒株之间核苷酸同源性为97.8%～100%；与国内外CPV参考株之间核苷酸同源性为98.2%～99.9%（如图3-2），氨基酸同源性为95.2%～100%；与国内外CPV参考株之间氨基酸同源性为96.7%～100%（见图3-3）。30 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析31 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析32 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析2.2.2CPV毒株分型统计通过297、300、426、440位氨基酸位点统计，对21株CPV毒株进行分型（见表3-4）。结果表明，其中QAU20170411、QAU20170602、QAU20170901、QAU20170902和QAU20170903五株为CPV-2C亚型；QAU20170408、QAU20170603、QAU20170608、QAU20170801和QAU20170804五株为CPV-2a亚型；其余11株均为CPV-2b亚型毒株。而且从表3-4中发现分离株中CPV-2a和CPV-2b基因型中第440位都已经突变为Ala，这一结论与已发表得出的结论一致。表3-4CPV亚型统计Table3-4StatisticsofCPVsubtypes毒株名称297300426440亚型QAU20170402AGDACPV-2bQAU20170403AGDACPV-2bQAU20170404AGDACPV-2bQAU20170405AGDACPV-2bQAU20170406AGDACPV-2bQAU20170407AGDACPV-2bQAU20170408AGNACPV-2aQAU20170410AGDACPV-2bQAU20170411AGETCPV-2cQAU20170412AGDACPV-2bQAU20170602AGETCPV-2cQAU20170603AGNACPV-2aQAU20170606AGDACPV-2bQAU20170608AGNACPV-2aQAU20170801AGNACPV-2aQAU20170802AGDACPV-2bQAU20170803AGDACPV-2bQAU20170804AGNACPV-2aQAU20170901AGETCPV-2cQAU20170902AGETCPV-2cQAU20170903AGETCPV-2c33 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析2.2.3犬细小病毒VP2基因进化分析用DNAStar软件绘制CPV进化树（图3-4）。结果显示，分离到的犬细小病毒株亲缘关系可分为三支：结果显示，分离到的犬细小病毒株亲缘关系可分为三支：QAU20170411、QAU20170602、QAU20170901、QAU20170902和QAU20170903为一支；QAU20170408、QAU20170603、QAU20170608、QAU20170801和QAU20170804为一支；QAU20170410、QAU20170412、QAU20170407、QAU20170802、QAU20170803、QAU20170606、QAU20170402、QAU20170403、QAU20170404、QAU20170405和QAU20170406为一支。CPV-2cCPV-2aCPV-2b图3-4CPVVP2核苷酸序列系统进化分析Fig3-4PhylogeniesoftheCPVVP2genesequences34 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析35 青岛农业大学硕士专业学位论文犬细小病毒VP2基因序列分析3讨论因为细小病毒中所有的中和抗原表位均位于VP2基因序列上，所以对VP2基因的比较和分型具有非常重要的生物学意义[55]。试验从青岛地区动物医院胶体金检测出来的犬细小病毒感染的发病犬粪便中分离出的细小病毒，根据流行病学研究、实验室检测证实该分离株为CPV，为分析毒株的遗传演化关系，所以对分离株进行了测序分析，测序结果表明，分离株之间氨基酸同源性为95.8%～100%；与GenBank参考的10株具有代表性的CPV基因组核苷酸序列比对同源性为96.4%～100%，此结果一方面说明国内外分离株基因序列差异不大，但从系统进化树分析上分析，分离株与国内毒株亲缘关系更近一些；另一方面说明同源性比对的结果相对低一些是因为此次分离得到的犬细小病毒基因型2a、2b、2c之间存在差异比较大。试验从随机选出的21株犬细小病毒中，2a亚型有5株，2c亚型有5株，剩下的11株全部为2b亚型，说明目前青岛市内已经是以CPV-2b亚型为主，兼有CPV-2a亚型和CPV-2c亚型[56]，这与王净等[57]报道中国大陆CPV流行规律一致。通过表3-4CPV亚型统计结果可以看出所有样品的297位氨基酸位点发生Ser→Ala的突变；所有样品300位氨基酸位点发生突变Ala→Gly；而CPV2a亚型的426位氨基酸位点为N；CPV2c亚型的426位点为E、440位点为T；这种突变趋势与国内外的报道相同[58]。36 青岛农业大学硕士专业学位论文全文总结全文总结1、本试验成功建立了细小病毒SHORT探针荧光定量PCR检测方法，最低可以检测21.4个拷贝数。运用该方法从临床样品中提取DNA进行检测，操作简便，一次可以同时检测96个样品，检测结果稳定，重复性好，灵敏度高，特异性强，为细小病毒的快速检测、准确诊断和流行病学调查提供了依据。2、用试验一已经建立好的细小病毒荧光定量PCR检测方法，采集了部分2017年全年送检的宠物医院疑似患犬细小病毒的动物进行胶体金检测、普通PCR检测和荧光定量PCR检测方法进行对比分析。其中，用胶体金试检测阳性率约为56.3%（49/87）；普通PCR检测阳性率约为60.9%（53/87）；荧光定量PCR检测阳性率约为67.8%（59/87）。因此，荧光定量PCR检测方法灵敏度和特异性要更好一些。3、因为细小病毒中所有的中和抗原表位都位于VP2基因序列上，所以本试验通过对临床疑似CPV感染的临床样品进行CPVVP2基因检测、序列分析等，对随机选出的21株进行测序分析，从测序结果及同源性比对上可以看出2a亚型有5株，2c亚型有5株，剩下的11株全部为2b亚型，而且犬细小病毒株与国内分离株的亲缘关系要比国外的近。为进一步的免疫监测和防控提供了基础。37 青岛农业大学硕士专业学位论文参考文献参考文献[1]AppelMJ,ScottFW,CarmichaelLE.Isolationandimmunisationstudiesofacanineparvo-likevirusfromdogswithhaemorrhagicenteritis[J].VetRec,1979,105:156-159.[2]张英.细小病毒的分子生物学[J].中国病毒学,1996,1(3):193-200.[3]Jeoung,SY,Ahn,SJ,Kim,D.GeneticanalysisofVP2geneofcanineparvovirusisolatesinKorea[J].J.Vet.Med.Sci,2008,70,719-722.[4]谢之景,夏咸柱,扈荣良，等.犬细小病毒基因型的调查[J].中国兽医学报，2004,24(5)：421-424.[5]RenzhouZhang,SongtaoYang,WeiZhang,etal.PhylogeneticanalysisoftheVP2geneofcanineparvovirusescirculatinginChina[J].VirusGenes,2010,40:397-402.[6]孔庆波，张彦明.犬细小病毒的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2003(4):54-58.[7]金曾范等.犬细小病毒肠炎的诊断报告[J].延边农学院学报,1987(2):58-69.[8]李六金,李秦,张海,等.犬细小病毒流行毒株的分离与鉴定[J].青海科技,2000(1):9-12.[9]谢之景,夏咸柱,扈荣良,等.犬细小病毒分离鉴定及其基因型调查的基础研究[J].中国动物保健,2003,12:21-23.[10]赵忠鹏,谢之景,夏咸柱,等.果子狸细小病毒的分离与鉴定[J].特产研究,2003(4):5-11.[11]AppleMJ,CooperBJ,GreisenH,etal.Canineviralenteritis.I.Statusreportoncorona-andparvo-likeviralenteritides[J].CornellVeterinarian1979,69：123-133.[12]AgbandjeM,ParrishCR,RossmannMG.Thestructureofparvoviruses[J].SeminarsinVirology,1995,6:299-309.[13]TsaoJ,ChapmanMS,AgbandjeM,etal.Thethree-dimensionalstructureofcanineparvovirusanditsfunctionalimplications[J].Science,1991,251:1456-1464.[14]SimpsonAA,ChandrasekarV,HebertB,etal.Hostrangeandvariabilityofcalciumbindingbysurfaceloopsinthecapsidsofcanineandfelineparvoviruses[J].JMolBiol,2000,300:597-610.[15]Reed,A.P,E.V.Jones,andT.J.Miller.Nucleotidesequenceandgenomeorganizationofcanineparvovirus[J].JVirol,1988,62(1):266-76.[16]Rhode,S.L,3rd,Nucleotidesequenceofthecoatproteingeneofcanineparvovirus[J].JVirol,1985,54(2):630-633.[17]潘红丽，仲飞，潘素敏，等.犬细小病毒NS1非结构蛋白可诱导细胞凋亡[J].微生物学报，2012，52(3)：367-373.[18]SteinelA,VenterEH,VanVuurenM,etal.AntigenicandgeneticanalysisofcanineparvovirusesinsouthernAfrica[J].OnderstepoortJVetRes,1998Dec,65(4):239-242[19]J.A.LopezdeTuriso,E.Cortes,C.Martinez,etal.Recombinantvaccineforcanineparvovirusindogs[J].J.Virol,1992,66:2748-2753.[20]ParrishCR.Emergence,naturalhistory,andvariationofcanine,mink,andfelineparvoviruses[J].Advancesinvirusresearch.1990,38:403-50.[21]ParrishCR,O'ConnellPH,EvermannJF,etal.Naturalvariationofcanineparvovirus[J].Science.1985,230(4729):1046-8.[22]PratelliA,AltamuraM,BuonavogliaD,etal.Evaluationofthenaturalimmunityinpupsinoculatedwithamodified-livecanineparvovirustype2b(CPV-2b)strain[J].Immunopharmacologyandimmunotoxicology.2000,22(3):451-64.38 青岛农业大学硕士专业学位论文参考文献[23]李君阁,朱尽国.犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒理化学和生物学特性的比较研究[J].国外兽医学-畜禽传染病,1985,5(6):58-61.[24]Ikeda,Y.,Mochizuki,M,NAIVto,R.,etal.Predominanceofcanineparvovirus(CPV)inunvaccinatedcatpopulationsandemergenceofnewantigenictypesofCPVincats[J].Virology278,13–19.[25]蔡宝祥主编.家畜传染病学[M].北京：中国农业出版社，2006:422-425.[26]GotoH,HiranoT',UchidaE,etal.Comparativestudiesofphysicochemicalandbiologicalpropertiesbetweencanineparvovirusandfelinepanleukopeniavirus[J].NihonJuigakuZasshi,1984,46(4)：519-526.[27]杨德威,宋延华,刘福安.犬场蚊子与犬细小病毒[J].广东畜牧兽医科技,2000,25(4)：16-18.[28]史利军,曾妮,李刚.犬细小病毒生物学特征及检测技术研究进展[J].动物医学进展，2010，31(4)：82-85.[29]叶俊华,刘清津,李刚.犬细小病毒病研究进展[C].中国畜牧兽医学会养犬学分会第十二次全国养犬学术研讨会论文集,2007,30(2)：60-67.[30]Remond,M.,Boireau,P.,Lebreton,F.PartialDNAcloningandsequencingofacanineparvovirusvaccinestrAIVn:applicationofnucleicacidhybridizationtothediagnosisofcanineparvovirusdisease[J].Arch.Virol,1992,127,257-269.[31]杨慧,曲光刚,赵元楷,等.犬细小病毒LAMP快速可视化检测方法的建立[C].《中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会（第三届中国兽药大会学术论坛）论文集》.[32]YinJL,ShackelNA,ZekryA,etal.Real-timereversetranseriPtasePolyerasechAIVnreaetion(RT-PCR)formeasurementofcytokineandgrowthfactormRNAexpressionwithfluorogenicProbesorSYBRGreenI[J].immunolCellBiol,2001,79(3):213-221.[33]LivakKJ,FloodSJA,MarmaroJ,etal.OligonucleotideswithfluorescentdyesatoppositeendsprovideaquenchedprobesystemusefulfordetectingPCRproductandnucleicacidhybridization[J].PCRMethodsAppl,1995,4(6):357-362.[34]LyamichevV,BrowMA,VarvelVE,etal.Comparisonofthe5'nucleaseactivitiesoftaqDNApolymeraseanditsisolatednucleasedomAIVn[J].ProcNatlAcadSci,1999,96(11):6143-6148.[35]王中力,宋哓晖,陈西召,等.犬细小病毒病免疫胶体金诊断技术的研究[J].中国预防兽医学报,2004,26(1)：62-66.[36]崔尚金,姜建宏,周艳君,等.猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术的建立和初步应[J].中国预防兽医学报,2005,27(3):213-216.[37]Desario,C.,Decaro,N.,Campolo,M.,etal.Canineparvovirusinfection:whichdiagnostictestforvirus?[J].J.Virol.Methods,2005,121,179-185.[38]MathysA,MuellerR,PeersenNC,etal.Comparisonofhemagglutinationandcompetitiveenzyme-linkedimrnunosorbentassayproceduresfordetcetingcanineParvovirusinfeees[J].AmJVetRes,1983,44(1):152-154.[39]刘宏伟,田克恭,渠川玫.犬细小病毒酶标试剂盒的研制[J].中国畜禽传染病,1994,6：11-13[40]ScottFW.Virucidaldisinfectantsandfelineviruses[J].AmJVetRes,1980,41,410–414.[41]HoustonDM,RibbleCS,HeadLL.Riskfactorsassociatedwithparvovirusenteritisindogs[J].JAmVetMedAssoc,1996,208:542-548.[44]邱薇,夏咸柱,范泉水,等.犬细小病毒血凝抑制抗体和中和抗体的关系[J].中国兽医科技,2000,30(10):3一5.[43]易立.犬细小病毒的分离鉴定,序列分析及VP2基因的融合表达[D].中国农业科学院硕士论39 青岛农业大学硕士专业学位论文参考文献文,2008:6.[44]帅小蓉,夏庆友.定量PCR技术的研究现状及应用概述[J].蚕学通报，2002,22.[45]刘海防,胡传伟,谢之景,等.犬细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立于初步应用[J].中国兽医学报，2010,30(5):593-596.[46]李英俊,史利军,李刚,等.犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立于评价[J].中国兽医学,2010,30(12)：1594-1597.[47]曹雪峰,弓超,王文博,等.犬细小病毒的新型原液荧光定量PCR方法的建立[J].中国兽医科学,2017,47(02):135-142.[48]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会.GB／T27533-2011犬细小病毒病诊断技术[S].北京：中国标准出版社，2011.[49]朱水芳.实时荧光聚合酶链式反应检测技术[M].中国计量出版社.2003,7.[50]NAIVarem1.AClosedtubefromatforamplificationanddetectionOfDNAbasedenergytransfer[J].NucleicAcidsRes,1997,25.[51]zratsukam.RapiddetectinofCYP2C9.3allelesbyrea1.TimefluorescencePCRbased$YBRGreen[J].MolGenetMetab,1999,68.[52]阳成波,印遇龙,龚建华,等.实时定量PCR研究进展及其应用[J].中国预防兽医学报,2003,25.[53]刘维全,范泉水,江禹,等.肉食兽细小病毒通用PCR诊断技术的建立[J].中国兽医学报,2001,21(3)：249-251.[54]ZHANGR,YANGS,ZHANGW,etal.PhylogeneticanalysisoftheVP2geneofcanineparvovirusescirculatinginChina[J].VirusGenes,2010,40(3):397-402．[55]ZHAOY,LINY,ZENGX,etal.GenotypingandpathobiologiccharacterizationofcanineparvoviruscirculatinginNanjing,China[J].VirolJ,2013,10:272．[56]ZHANGQ,XUXM,ZHAIVGQ,etal.MolecularcharacterisationofcanineparvovirusstrAIVnscirculatinginChina[J].AfrJBiotechnol,2010,9(29):4556-4560．[57]王净,李英俊,李刚,等.犬细小病毒北京分离株VP2基因克隆及变异分析[J].中国兽医学报,2011，31(5)：649-653.[58]XUJ,GUOHC,WEIYQ,etal.PhylogeneticanalysisofcanineparvovirusisolatesfromSichuanandGansuprovincesofChinain2011[J].TransboundEmergDis,2015,62(1):91-95．[59]ZHANGRZ,YANGST,FENGH,etal.Thefirstdetectionofcanineparvovirustype2cinChina[J].JPathogBiol,2010,5(4):246-249．[60]StrassheimML,GruenbergA,VeijalAIVnenP,etal.Twodominantneutralizingantigenicdeterminantsofcanineparvovirusarefoundonthethreefoldspikeoftheviruscapsid[J].Virology,1994,198(1):175-184.[61]李河林,焦铁军,刘淑红,等.犬细小病毒病研究进展[J].动物医学进展,2008，29(5)：73-77.40 青岛农业大学硕士专业学位论文导师组意见缩略词表英文缩写英文全称中文全称及注释AIVavianinfluenzavirus禽流感病毒AlaAlanine丙氨酸AsnAsparagine天冬酰胺AspAsparticacid天冬氨酸CCVCaninecoronavirus犬冠状病毒CDVCanineDistemperVirus犬瘟热病毒CAVCanineadenovirus犬腺病毒CPVCanineparvovirus犬细小病毒CPV-2Canineparvovirustype2犬细小病毒2型CPV-2aCanineparvovirustype2a犬细小病毒2a型CPV-2bCanineparvovirustype2b犬细小病毒2b型CPV-2cCanineparvovirustype2c犬细小病毒2c型ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FQ-PCRReal-timeQuantitativePCR实时荧光定量PCRFPVFelinepanleukopeniavirus猫细小病毒GluGlutamicacid谷氨酸GlyGlycine甘氨酸HAHemagglutinationassay血凝实验HIHemagglutinationinhibition血凝抑制实验LBLuria-bertanimediumLB－培养基LeuLeucine亮氨酸MEVMinkenteritisvirus水貂肠炎病毒MetMethionine蛋氨酸NSNon-structuralprotions非结构蛋白ORFOpenReadingFrame开放阅读框PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液TyrTyrosine酪氨酸41 青岛农业大学硕士专业学位论文导师组意见导师组意见导师组已通过的论文审查，同意并推荐其参加硕士学位论文答辩。导师：导师组成员：年月日42 青岛农业大学硕士专业学位论文致谢致谢本论文是在我的导师青岛农业大学动物医学院院长单虎教授和青岛农业大学动物医学院张传美副教授的悉心指导下完成的。导师精益求精的工作作风，严谨的科学态度，诲人不倦的高尚师德和平易近人的人格魅力深深地感染和激励着我。从进入研究生生活开始，课题的选择到试验的最终完成，导师都始终给予我细心的指导和不懈的支持，在此主要向单院长和张老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意；感谢动物医学院的老师们对我的支持和帮助，在此，我也要向各位老师深深地鞠上一躬；感谢给我提供参考文献的学者们，谢谢他们给我提供了大量的文献，使我在写论文的过程中有了参考的依据；感谢师兄、师姐在实验上给予我的关心和帮助；感谢我的同级好友和我的师妹刘佳卉在工作、学习和生活上，给予我的关照、理解和支持；更要感谢我的父母，没有他们的勤勤恳恳和细心安排、没有他们的支持和鼓励，我是无论如何也完成不了我的研究生生活。研究生两年的生活已经接近尾声。当自己怀着忐忑不安的心情完成这篇毕业论文的时候，回想自己这十几年的求学生涯，经历了许多波折，实属不易。所以，我一定要感谢那些在我求学时对我经济和精神上帮助的亲戚、朋友、老师和同学们。青岛农业大学优美的校园环境、严谨的学风使我研究生期间过的很充实和愉快。虽然老师和同学都是新的，环境也是新的，但是我仍然感受到了那种来自老师和同学们的热情和融洽！在这篇论文构思和写作过程，我的论文指导老师对我论文的完成更是功不可没，张传美老师每次对我的疑问给予细心的解答，对我的论文进行细心的修改，才使得我的论文结构一步一步的完善。没有老师的细心指导，这篇论文是不可能完成的。书到用时方恨少，在这篇论文的写作过程中，我深感自己的水平还非常的欠缺。生命不息，学习不止，人生就是一个不断学习和完善的过程，在今后的生活中，我也会以各位老师为榜样，向老师学习，最大程度的体现自己的人生价值。姜玮2018.0643