《犬瘟热、犬细小病毒二重taqmanmgb荧光定量pcr检测

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《犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法》河南省地方标准编制说明犬瘟热（Caninedistemper，CD）是世界范围内广泛发生的一种犬的急性、高接触性传染病，其病原为犬瘟热病毒（CDV），于1905年首次报道，其自然宿主包括大部分的食肉目动物。该病传染性强，易继发细菌和其他病毒的混合感染或继发感染，发病率高达80%，康复后易出现麻痹、抽搐、癫痫样发作等后遗症。该病无特效药物治疗，成为危害养犬业的主要疫病之一。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属、负链单股不分节的RNA病毒，基因组全长为15616bp。病毒的蛋白主要有核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质膜蛋白(Matrixprotein,M)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、附着或血凝蛋白(AttachmentproteinorHemagglutininprotein,H)、大蛋白(thelargevirusspecificiedRNAdirectedRNApolymeraseprotein,L)6种，编码基因在基因组的位置从它的3'端到5'端依次为3c端前导序列、N、P、M、F、H和L基因以及5c端前导序列，其中H蛋白是CDV与细胞受体结合的蛋白，并决定着病毒感染的细胞嗜性，H蛋白基因常作为诊断检测所用的靶基因。犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起犬的一种急性接触性传染病，病犬主要以剧烈呕吐、出血性肠炎、严重脱水、白细胞减少和心肌炎等为主要特征，犬细小病毒于1978年从患有肠炎的病犬体内首次分离获得，幼犬对CPV的易感性较高，并可以发生心肌炎。发病率高达50%~100%，病死率为10%~50%，对养犬业、犬科经济动物养殖和犬科野生动物危害巨大。CPV是细小病毒科、细小病毒属成员，具有细小病毒属病毒典型形态和结构。基因组为单股DNA，病毒粒子有VP1、VP2和VP3三种多肽，其中VP2为衣壳蛋白主要成分，为主要抗原基因，常作为检测CPV的主要靶基因。临床上CDV、CPV多混合感染，是当前严重危害犬、猫健康的主要疫病，防控难度大，对养犬业危害严重，每年均造成巨大的经济损失。由于二者引起的临床症状相似，单凭临床症状和剖检病变难以确诊，因此必须借助实验室检测进行确诊。目前已有的CDV/CPV的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫荧光法(IF)、免疫组织化学技术(IHT)、免疫电镜法(IEM)、血凝/血凝抑制试验（HA/ HI）、中和试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，这些方法存在操作繁琐、技术要求和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满足快速、大量检测的需要，并且是针对某一种病毒的单一PCR或FQ-PCR检测方法。因此急需建立一种快速、高效、特异、敏感的检测方法，且同时对CDV和CPV两种病毒核酸进行快速鉴别检测。2013年5月，农业部下发了《关于进一步加强犬和猫产地检疫监管工作的通知》（农医发〔2013〕16号），要求对所有跨省调运的犬、猫进行CDV、CPV实验室病原学检测，实验室检测结果作为出具检疫证明和是否许可调运的重要依据。单就河南省而言，每年需要对CDV、CPV检测量至少在5000万头份以上，这要求实验室必须对CDV、CPV进行快速、准确、大量检测。目前国内外已报道的CDV、CPV病原学快速检测方法有针对该病原的单一PCR或FQ-PCR检测方法，但未见有针对CDVH基因和CPVVP2基因设计了特异性引物对和TaqManMGB探针建立CDV/CPV荧光定量PCR方法。本标准所建立的犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法反应可在1h～2h内完成，减少了电泳环节的时间和污染，TaqManMGB探针能区分目的基因中1个碱基的差别，因此该方法具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速诊断CDV、CPV的要求，对及早快速确诊CDV、CPV病，有效防控疫病的发生，防止病原传播扩散，维护养犬业、经济动物养殖业和宠物养殖的健康发展，保障公共卫生安全和社会稳定，保护宠物饲养者权益等具有重要意义。该技术标准具有实用性和可操作性，若采纳、颁布实行后，将为我省CDV、CPV 的临床快速确诊和跨省调运工作提供技术保障。一、工作简况，包括任务来源、起草单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作：1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2016年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2016〕127号）的要求，由河南省动物疫病预防控制中心负责对河南省地方标准《犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法》的起草、制定工作。2、起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。3、主要工作过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法的建立。1、引物设计由河南省动物疫病预防控制中心经大量比对GenBank中CDV、CPV基因序列，选取CDVH基因和CPVVP2基因高度保守且特异性基因序列为模板，针对CDVH基因设计1对特异性引物和1条标记为FAM的TaqManMGB探针，针对CPVVP2基因设计1对CPV特异性引物和1条标记为VIC的TaqManMGB探针， 其中CDV探针报告基团为FAM，CPV探针报告基团为VIC，淬灭基团均为None。2、二重TaqManMGBFQ-PCR检测程序参数的优化利用实验室保存的样品，根据引物的Tm值、扩增片段的大小、PCR聚合酶的性质，优化了CDV、CPV二重FQ-PCR方法的退火温度、循环数、CT值等参数，确定了FQ-PCR方法检测程序，包括所使用的试剂规格、仪器参数等。3.确定建立检测方法的灵敏性、特异性及重复性。对疑似CDV、CPV感染的患犬样品提取核酸，FQ-PCR扩增的阳性样品再进行普通PCR扩增，对阳性扩增产物分别克隆入pGEM-TEasy载体中，筛选阳性重组质粒进行测序，制备含CDVH基因和CPVVP2基因的重组质粒作为标准品，将标准品以1.0×100～1.0×109倍倍比稀释作为模板扩增，建立标准曲线，与普通CDVPCR方法、普通CPVPCR方法比较验证该方法的敏感性；采用FQ-PCR方法扩增I型和II型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)、狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）、弓形虫、犬传染性肝炎（CIHV）、犬钩端螺旋体，验证该方法的特异性；对1.0×106～1.0×103个拷贝/µL的标准品进行3次重复测定，检测其稳定性和重复性；将该方法检测出的阳性样品进行目的基因的克隆测序和病毒分离试验，验证所建立方法的准确性。试验结果证明所建立的 犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好，敏感性强，可以作为确诊CDV、CPV感染的实验室快速检测方法。4、用建立的犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法检测临床样品，并对部分结果进行测序，以验证该方法的实用性。第二阶段：犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法的应用实验。本阶段主要进行犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测试剂盒的组装及在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省动物疫病预防控制中心组装犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法试剂盒，并由河南省18个省辖市和2个省直管试点县（市）动物疫病预防控制中心进行临床样品检测应用试验。共对来自全国7个省（主要样品来自河南省）共计896份疑似CDV感染样品进行了应用检测；对其中12份样品进行了病毒分离鉴定和阳性样品的克隆测序对照试验。18个省辖市和2个省直管试点县（市）动物疫病预防控制中心参与实验人员对该诊断方法包括试剂盒的组装、反应条件的优化等提出了不同的修改意见和建议；对该方法的准确性、特异性、敏感性等进行了充分实验并得出了肯定意见。 第三阶段：标准的起草、修改与制定。根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了《犬瘟热、犬细小病毒实时荧光定量PCR检测方法》河南省地方标准草案，规定了诊断范围、样品采集及处理方法、实验操作方法、结果判定标准等，并将标准草案送有关兽医专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的《犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法的建立（草案）》。4、主要起草人及其所做的工作项目主持人：闫若潜，河南省动物疫病预防控制中心，主持本项地方标准的制定与编写。参加者：班付国：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定和试验技术推广。王华俊：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定和检测方法的优化。方先珍：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。刘梅芬：河南省动物疫病预防控制中心，负责标准的制定和检测方法的优化。赵明军：河南省动物疫病预防控制中心， 负责标准的制定、校订和优化。张代宝：郑州市动物疫病预防控制中心，负责标准的推广。二、地方标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据）：按照标准编制的有关要求，以河南省动物疫病预防控制中心为主要组织者，以河南省18个省辖市和2个省直管试点县（市）动物疫病预防控制中心为主要参与单位，通过对来自7个省的大量临床疑似样品进行检测应用，结合临床症状及与其它方法的对照试验，同时经征求国内相关专家意见，对获取的实验数据进行科学统计分析，力求标准客观公正、真实科学、易于操作、便于推广，体现先进性，增强其指导性。（一）引物设计由河南省动物疫病预防控制中心经大量比对GenBank中CDV、CPV基因序列，因高度保守且特异性基因序列,选取CDVH基因和CPVVP2基为模板，针对CDVH基因设计1对特异性引物和1条5'端标记为FAM的TaqManMGB探针，针对CPVVP2基因设计1对CPV特异性引物和TaqManMGB探针，其中CDV探针报告基团为FAM，CPV探针报告基团为VIC，淬灭基团均为None， 在国内首次建立了犬瘟热、犬细小病毒二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法的建立，该方法快速、特异、灵敏，可用于临床上快速检测CDV、CPV，适合于大规模群体检测，特制定本标准。（二）标准方法的特异性利用本标准制定的犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测方法扩增CDV、CPV、I型和II型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)、狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）、弓形虫、犬传染性肝炎（CIHV）、犬钩端螺旋体，验证该方法的特异性。结果显示，该方法能特异性的扩增出CDV、CPV标准曲线，但对CAV-1、CAV-2、RV、CPIV、CIHV、弓形虫、犬钩端螺旋体等病原扩增不出任何曲线，说明标准所规定的诊断方法特异性好。整个实验过程约需1～2h，操作步骤按常规FQ-PCR方法进行，说明标准规定的方法快速、简便，易于临床检测应用及大范围推广。(三)标准方法的敏感性对疑似CDV、CPV感染的患犬样品提取核酸，FQ-PCR扩增的阳性样品再进行普通PCR扩增，对阳性扩增产物分别克隆入pGEM-TEasy载体中，筛选阳性重组质粒进行测序，制备含CDVH基因和CPVVP2基因的重组质粒作为标准品，将标准品以1.0×100～1.0×109倍倍比稀释作为模板扩增，建立标准曲线。 FQ-PCR扩增的阳性样品再使用559bp大小的特异性引物对进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆测序，制备含CDVH基因的重组质粒作为标准品，将标准品以1.0×100～1.0×109倍倍比稀释作为模板扩增，建立标准曲线。对采用FQ-PCR扩增出的CDV阳性样品基因片段进行克隆，以已知浓度的pGEM-Teasy重组质粒溶液作标准品，10倍系列稀释成每微升1.0×108～1.0×100拷贝为模板，同时设空pGEM-Teasy质粒为阴性对照，用标准规定的方法进行敏感性检测。结果该FQ-PCR方法对CDV、CPV重组质粒检测的最低极限均为10个拷贝/μL。说明标准规定的方法敏感度好，阳性检出率高，适用于临床样品检测应用。（四）应用范围利用建立的方法对896份犬眼分泌物、泪液、唾液、咽喉拭子、粪便、肺脏、淋巴结样品进行检测实验，结果表明，本标准所建立的方法对所有样品均能进行有效检测。（五）临床应用实验对来自全国7个省的896份疑似CDV/CPV感染样品进行了应用检测实验，共检测出CDV/CPV阳性样品107份，检测结果与临床发病症状、病理剖检变化及部分样品的病原分离培养结果等具有较高的符合率，说明标准规定的方法可以进行大范围的推广应用。 三、主要试验（验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果：由CDV/CPV引起的犬瘟热/犬细小病毒疫病对养犬业、宠物饲养危害严重，当前，缺乏快速敏感的鉴别诊断CDV/CPV感染的方法。FQ-PCR诊断方法具有快速、特异、敏感等优点，已在疫病病原学诊断中得到广泛应用，成为动物疫病病原学快速诊断方法之一。本标准所建立的CDV/CPVFQ-PCR方法快速、特异、敏感，对于临床上CDV/CPV的快速诊断具有重要意义。该标准具有实用性和可操作性，若采纳、颁布实行后，可对CDV/CPV进行快速准确的鉴别诊断，从而及早进行对症治疗，及时控制疾病，降低经济损失，具有重要意义。四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据比对：经大量比对GenBank中CDVH基因和CPVVP2基因序列，选取CDVH基因和CPVVP2基因高度保守且具有型特异性基因序列为模板，设计CDV/CPV特异性引物对和TaqManMGB探针，经反复试验验证后，建立了CDV/CPVFQ-PCR检测方法。用建立的FQ-PCR诊断方法对I型和II型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)等5种对照病原体核酸、已知的CDV/CPV感染样品、健康犬眼分泌物 和组织样品等样品为对照进行特异性检测，证明了方法的特异性。敏感性试验表明该方法最低检测极限为10copy/uL。对检测阳性扩增样品再采用普通RT-PCR进行扩增和克隆测序结果证明扩增的标准曲线CDV/CPV扩增曲线。4次重复试验结果完全一致，表明方法具有好的重复性。经对采用本标准规定的FQ-PCR诊断方法检测过的30份样品（CDV/CPV阳性23份，阴性7份）进行病毒分离培养对照试验，结果：两种实验方法得到的结果完全一致，二者符合率为100%。与《犬瘟热诊断技术》（GB/T27532-2011）中的RT-PCR方法进行比对试验，二者的复合率也为96.7%。以上实验结果证明了本标准制定的CDV/CPVFQ-PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。五、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系：本标准是为了更好地贯彻《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》以及有关的法律法规，加快我国动物防疫标准化工作进程，适应我省犬瘟热病、犬细小病毒病的防控工作需要，也是对《犬瘟热诊断技术》（GB/T27532-2011）的重要补充。六、重大分歧意见的处理经过和依据：在本标准的制定过程中，相关审稿专家没有提出重大分歧意见。 七、地方标准作为强制性地方标准或推荐性地方标准的建议：该项技术标准的制定，试验数据充分，科学性强，并经过了长期大量实际应用，可作为河南省推荐性地方标准在犬瘟热的研究、诊断、防治、检疫和流行病学调查工作中进一步推广应用。八、贯彻地方标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容）：建议以培训班的形式推广本标准。九、废止现行有关标准的建议：无。十、其他应予说明的事项：无。河南省动物疫病预防控制中心标准编制组二0一六年七月二日