犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法

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ICS 11.220B41     DB21辽宁省地方标准DB21/XXXXX—XXXX     犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法DetectionoffluorescentquantitationPCRforBabesiacanis点击此处添加与国际标准一致性程度的标识  本稿完成日期：2018年9月 XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省质量技术监督局   发布 DB21/XXXXX—XXXX目  次前  言II1　范围12　规范性引用文件13　缩略语14　原理15　仪器和器材16　试剂和引物27　样品的采集和前处理28　操作步骤29　检测过程中防止交叉污染的措施310　废弃物处理44 DB21/XXXXX—XXXX前  言　　本标准按照GB/T　1.1—2009给出的规则起草。　　本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。　　本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：高志峰、张才、杨国丽、邓文超、张健、马建山、高原、兰德松。4 DB21/XXXXX—XXXX犬巴贝斯虫荧光定量PCR检测方法1　范围本标准规定了犬巴贝斯虫的荧光定量PCR检测方法的技术要求，包含规范性引用文件、缩略语、原理、仪器和器材、试剂和引物、样品的采集和前处理、操作步骤、检测过程中防治交叉污染的措施、废弃物处理等。本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行全血液样品中犬巴贝斯虫核酸的检测，适用于犬巴贝斯虫病的确诊及流行病学调查。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB　19489　实验室生物安全通用要求GB/T　19495.2　转基因产品检测　实验室技术要求中华人民共和国农业部公告2003年第302号《兽医实验室生物安全技术管理规范》中华人民共和国农业部公告2017年第25号《病死及病害动物无害化处理技术规范》3　缩略语该部分对本技术规范中用到的缩略语进行了注解：DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：碱基对（basepair）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）4　原理巴贝斯虫病是指由巴贝斯科的原虫所引起的一种梨形虫病，主要以侵害家畜的红细胞为特征的血液原虫病。犬巴贝斯虫病是一种经硬蜱传播的血液原虫病，临床上以严重贫血、高热、黄疸、呼吸困难为特征。根据犬巴贝斯虫（Babesiacains,B.canis）裂殖子基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5　仪器和器材4 DB21/XXXXX—XXXX5.1低温高速离心机（最大离心力12000rpm）.5.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1　℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。5.3生物安全柜。5.4荧光PCR扩增仪。5.5分析天平。5.6离心管：1.5　ml离心管和0.2　ml　PCR专用离心管。5.7微量可调移液器：1000　μl，200　μl，100　μl，50　μl，20　μl，10　μl，2　μl。1　试剂和引物注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含RNA或RNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。6.15mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)6.2灭菌双蒸水6.370%乙醇6.4犬巴贝斯虫阳性对照组基因6.5特异性引物：正向引物：5’-TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3’反向引物：5’-TCCATGCTGAAGTATTCAAGACACA-3’。6.6基因组DNA纯化试剂盒100次、购自TaKaRa公司，常温保存6.7荧光定量试剂盒FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)。产品在-15至-25℃条件下可稳定存放至标签上的有效期之前。若存放于2～8℃条件，仅可短期储存不超过1个月。2　样品的采集和前处理7.1于犬前肢臂头静脉取300µl抗凝血，4℃保存，4h内使用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA。将获得的DNA放置﹣20℃保存。7.2采样时避免接触血液，尽量使用一次性采血针及配套采血管（EDTA，2Na-EDTA，肝素均可）采血。7.3采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6～8h之内运送到实验室。7.4按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。3　操作步骤3.1　全血基因组的提取8.1.1按处理血液样品数准备1.5ml离心管，并各加入GenTLESolutionI500μl。8.1.2把混合均匀的100μl血液，加入到分装好的GenTLESolutionI的离心管中，立即振荡数秒钟。不管处理多少样品，血液加入到GenTLESolutionI中，要立即进行振荡混合，否则有可能降低收取的DNA量。4 DB21/XXXXX—XXXX8.1.3室温放置10min以上，然后在室温条件下12000rpm离心5min。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳朵朝上。此时几乎看不到DNA沉淀。若离心温度低，会对收取的DNA量和纯度有影响，请于20℃以上离心。8.1.4用移液器小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带小耳朵一侧）的内壁上，除去溶液时，请一定注意微量移液器吸头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，注意不要吸走沉淀物。8.1.5加入1ml的GenTLESolutionII。此时GenTLESolutionII应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中。特别注意操作步骤4（除去GenTlESolutionI和血液混合物）以及操作步骤10（除去GenTLESolutionIII和异丙醇混合物）的实验操作特别重要，请严格按操作方法进行。8.1.6轻柔地上下颠倒离心管数次，室温12000rpm以上离心2min，用微量移液器小心地除去上清溶液（方法参见实验操作4）。剧烈振荡将影响收量和纯度。8.1.7向离心管中加入GenTLESolutionIII500μl，轻微振荡10s充分混合。8.1.8室温12000rpm离心5min，把上清溶液移至另一个新的离心管中。8.1.9加入等体积（约500μl）的异丙醇，轻柔地上下颠倒数次，均匀混合。8.1.104℃、12000rpm离心5min，小心除去上清溶液。GenTLESolutionIII中含有影响酶反应的物质，所以一定要除净上清溶液，但应注意不要吸走沉淀。8.1.11加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12000rpm离心5min，小心地除去上清溶液（方法参见4）。8.1.12干燥沉淀。因为该方法提取的DNA较大，完整性好，所以请一定不要干燥过度。Tube（离心管）中看不到有明显的液体或没有乙醇气味后，就可以加入TE进行溶解。如果沉淀已经变白，说明干燥过度，此时加入TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能会受到影响。8.1.13根据下一步实验需要，用10～50μl适当的5mMol/L的Tris/HCl(pH7.5～8.0)溶解沉淀。1.1　荧光定量PCR的方法8.2.1冰上操作。8.2.2准备0.2mlTube若干（数目为样品数目+2）。8.2.3向每个管中加入（1）2×SYBRMasterMix10.0µl；（2）20µmol/l正反向引物各0.1µl；（3）去离子水7.8µl；（4）样品2µl，其中2个管分别加入2µl灭菌双蒸水和2µl阳性对照基因。8.2.4震荡混匀后使用离心机离心，此时拿出Tube时应小心不可以让聚集在管底的液体弹起。8.2.5放入荧光定量PCR仪，反应条件为：95℃3min，95℃15s，60℃60s，72℃30s，35个循环。8.2.6荧光定量PCR反应结束后，从荧光定量PCR仪直接调取荧光定量PCR溶解曲线数据，进行溶解曲线分析。1.2　结果判定当样品的荧光定量PCR溶解曲线数据与阳性对照一致为有规律的扩增曲线，而空白组（即双蒸水组）无扩增曲线时，则样品为检测阳性样品；若当样品的荧光定量PCR溶解曲线数据与空白组（即双蒸水组）一致无扩增曲线，而阳性对照可见有规律的溶解曲线，则样品为检测阴性样品。2　检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T　19495.2的规定执行。4 DB21/XXXXX—XXXX1　废弃物处理按照GB19489的规定执行。_________________________________4