马驽巴贝斯虫二温式、荧光pcr检测方法的建立及其初步应用

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4、主持人：巴音查汗教授(新疆农业大学)本文是在新疆维吾尔自治区“产学研联合培养研究生示范基地”—伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心完成马驽巴贝斯虫二温式PCR及荧光PCR检测方法的建立及其初步应用摘要马驽巴贝斯虫病病原为驽巴贝斯虫，该病是一种经由媒介蜱虫传播的严重影响马属动物健康的血液原虫病，被世界卫生组织（OIE）列为法定报告检疫疫病，在我国该病被列为二类动物疫病。该病呈全球性发生，患马呈现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿，急性病例死亡，亚急性、慢性病例终身成为带虫宿主，造成本土马与引进马互相感染、反复发病，给马养殖业造成重大

5、损失。目前尚无该病的有效治疗药物及疫苗，故研发新型检测技术是有效的防控途径，可及时检测、监控和综合防治，有利于马产业的健康发展。(Ⅰ)根据GenBank中的驽巴贝斯虫（Babesiacaballi）Bc48基因序列设计了一对特异性引物，建立检测驽巴贝斯虫的二温式PCR方法。该方法能够特异地扩增155bp的片段，与双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、马泰勒虫、瑟氏泰勒虫均无交叉反应，能检测到的最低DNA拷贝数为5.17×102copies/μL。应用所建立的方法检测了采集于和静县焉耆马匹样品（N=82），结果显示，马驽巴贝斯虫感染率69

6、.51%（57/82），与血液涂片检查结果37.8%（31/82）相比，其检出率更高。该二温式PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性，可用于马驽巴贝斯虫的早期诊断。(Ⅱ)根据Bc48保守部分基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针，建立了驽巴贝斯虫病的MGBFQ-PCR检测方法。对所建立的FQ-PCR检测方法进行特异性、灵敏性和重复性试验，并分别用FQ-PCR检测方法和普通PCR方法对临床样品进行检测对比。结果显示，该方法灵敏度高，最小检出量为5.17×101copies/μL的标准质粒，比常规PCR灵敏100倍；建立的F

7、Q-PCR检测方法标准曲线的循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.9996，重复性好，组内与组间重复性试验的变异系数分别为0.7%和0.42%，均小于1%；该方法能特异性检测驽巴贝斯虫，而对马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫等病原检测结果均为阴性。用建立的MGB-FQPCR和常规PCR分别对90份临床样品进行检测，MGB-FQPCR和常规PCR检出率分别为53%和30%。本次建立的驽巴贝斯虫病MGB-FQPCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于马驽巴贝斯虫病临床样品诊断、流行病学调查，将为

8、蜱传马梨形虫病的检测提供新的方法。关键字：马驽巴贝斯虫;二温式PCR；荧光定量PCR；建立与初步应用IEstablishmentoftwo-temperaturePCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethodfordiagnosingBabesiaca