牛巴贝斯虫病实时荧光pcr诊断方法的建立及其初步应用研究

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1、分类号:S852.72学校代码:10758密级:公开学号:1036020244硕士学位论文牛巴贝斯虫病实时荧光PCR诊断方法的建立及其初步应用研究EstablishmentofReal-timefluorescencePCRMethodsforDiagnosingBovineBabesiosisanditsApplications研究生姓名刘启生导师姓名及职称巴音查汗教授学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向寄生虫免疫学及原虫分子生物学所在学院动物医学学院新疆·乌鲁木齐二○一三年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我

2、所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:时间:年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论

3、文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名:时间:年月日导师签名:时间:年月日2本文是国家自然科学基金“新疆蜱传原虫病分子免疫流行病学研究”(项目编号：30960282)；国家自然科学基金-新疆联合基金“新疆自然放牧区域蜱虫种群分布及其蜱传病地方流行关系的研究（项目编号：U1170301）”的部分研究成果课题主持人：巴音查汗教授（新疆农业大学）本论文同时受到“新疆农业大学动物医学学院与伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心共建自治区产学研联合培养研究生示范基地”的资助I牛巴贝斯虫病实时荧光PCR诊断方法的建立及其初步应用研究摘要牛巴贝斯虫病（Bovin

4、ebabesiosis）是由巴贝斯科巴贝斯属的原虫寄生于牛类动物红细胞内所引起的蜱传血液原虫病。该病对牛群危害严重，病牛贫血、血尿、迅速消瘦，病程后期死亡率高，对畜牧生产造成重大损失。因此，建立准确、灵敏、快速的检测、诊断技术，对该病的早期诊断、流行病学研究和综合防治具有重大意义。(Ⅰ)为建立牛巴贝斯虫(Babesiabovis)的TaqMan实时荧光PCR检测方法，本研究根据GenBank中牛巴贝斯虫的18SrRNA基因保守序列，设计引物和TaqMan探针，通过优化反应体系，建立检测牛巴贝斯虫的实时荧光PCR方法。试验结果表明：实时荧光PCR对靶基因的最低检测值1为1.31

5、×10copies/μL，比常规PCR的敏感性高1000倍；而且与牛的其他血液原虫无交叉反应；组内及组间重复性试验的变异系数均小于2%，具有良好的重复性；在23份被检样品中，实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为52.17%和30.43%。(Ⅱ)根据双芽巴贝斯虫（Babesiabigemina）18SrRNA基因的保守序列，设计特异性引物和TaqMan探针，建立了检测双芽巴贝斯虫的实时荧光PCR方法。该方法灵敏度高，最小检出量为11.1×10copies/μL的标准质粒，比常规PCR灵敏1000倍；重复性好，组内和组间重复性试验的变异系数分别为0.21%1.14%和0.3

6、1%1.50%，均小于2%；特异性强，对牛常见的其他两种血液原虫和健康血液无交叉反应。用建立的实时荧光PCR和常规PCR分别对30份临床样品进行检测，实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为30%和16.7%。(Ⅲ)分别应用本研究建立的实时荧光PCR对采自新疆部分疑似区牛（牦牛）样品（N=590）进行了牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫检测，牛巴贝斯虫阳性率为7.12%，双芽巴贝斯虫阳性率为6.10%；喀什地区的牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫阳性率较高，分别为13.33%和11.67%；犊牛对牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的感染率均高于成年牛，阳性率分别达到了9.52%和8.73%；牦牛的感染率

7、高于其他品种。与ELISA和血涂片镜检结果对比表明，实时荧光PCR更能特异准确的确诊巴贝斯虫感染。本研究建立的实时荧光PCR检测方法，可以灵敏、特异的快速定性检测巴贝斯虫（Babesiabovis、Babesiabigemina），可用于该病的流行病学调查、日常监测，为蜱传原虫病的早期诊断和及时防治提供快速有效的检测手段，为蜱媒病的相关研究提供技术支持。关键词：牛巴贝斯虫；双芽巴贝斯虫；实时荧光PCR；检测；应用IEstablishmentofreal-timefluorescencePCRmethod