沙门菌多重pcr检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroa缺失株的构建

《沙门菌多重pcr检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroa缺失株的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学位论文沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建DevelopmentofaMutiplexPCRforDetectionofSalmonellaandConstructionofSalmonellaPuilorumaroAMutants公益行业专项(201303044)研究生：杨林专业：预防兽医学导师：彭大新教授陈素娟副教授扬州大学兽医学院2014年6月杨林：沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建三沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA繁黧鼍／／lⅧl[I／I／Hl[[1l

2、lllllll／]1301lll／／／llll[／lllll／6[1[1l／2633ti硕士研究生：杨林丫1众摘要沙门菌是一种兼性胞内致病菌，能够引起系统或局部感染。宿主感染后既可引起胃肠炎、流产、败血症等症状，又可表现为带菌不发病的状态。随着抗菌药物在临床和动物饲料中的广泛使用，沙门菌耐药性日趋严重，在多种动物中的感染率亦逐渐上升，引起了巨大的经济损失。沙门菌的鉴定主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等传统方法，但是传统方法费时费力，有些血清型难以区分。因此，迫切需要一种能够快速检测沙门菌的方法，并且采取有效的防制措施来降低家禽的感

3、染率，提高家禽及其产品的质量。本研究根据沙门菌属特异性基因(hut)及肠炎沙门菌(SdfI)，鼠伤寒沙门菌(Spy)，鸡白痢沙门菌(glgC)，鸡伤寒沙门菌(gtgC和speC)的血清型特异性基因分别设计一对引物，建立了mPCR方法，可同时检测鉴定出肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及鸡伤寒沙门菌。选取由mPCR方法鉴定出的鸡白痢沙门菌S004、S005、S017及实验室保存菌$6702株，利用LRed同源重组技术，成功构建了鸡白痢沙门菌aroA缺失株：S004AaroA、S005AaroA、S017ziaroA和S6702AaroA

4、，并对其生物学特性及毒力进行了测定，为沙门菌减毒活疫苗的研制奠定了基础。1快速检测肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌mPCR方法的建立根据沙门菌属特异性基因(hut、495bp)及肠炎沙门菌(SdfI、304bp)、鼠伤寒沙门菌(Spy、401bp)、鸡白痢沙门菌(glgC、252bp)和鸡伤寒沙门菌(glgC、252bp和speC、174bp)的血清型特异性基因分别设计引物，调节模板用量，dNTP、Taq酶的比例和退火温度，建立mPCR方法。菌液PCR敏感度结果显示：肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的最低检出量均为3

5、×103CFU；提取沙门菌DNA的敏感度结果显示：鉴别肠炎、鼠伤寒、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的最低检量分别为162pg／pL、202pg／laL、214pg／I．tL和178pg／l上L。与常规的分离鉴定相比，所建立的mPCR检测沙门菌属和鼠伤寒扬州大学硕士学位论文沙门菌的敏感性、特异性、符合率均为100％；检测肠炎沙门菌的敏感性、特异性、符合率分别为100％、98％、98．2％；检测鸡白痢沙门菌的敏感性、特异性、符合率分别为100％、94．6％、96．4％。不在其中的血清型也可以通过属特异性基因hut基因的扩增检测出，因此不会漏检临床样品中

6、的沙门菌。2鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性的初步研究根据GenBank提供的基因序列扩增鸡白痢沙门菌临床分离菌株的aroA基因。利用九Red同源重组技术，构建鸡白痢沙门菌aroA缺失株：S0043aroA、S005AaroA、S017AaroA和S67023aroA。通过PCR鉴定，缺失株构建成功。4株野生株及其缺失株的生长曲线显示，野生株中$6702生长速度最快，其它3株鸡白痢沙门菌生长速度相似：与野生株相比，缺失株的生长速度均有所下降，缺失株中S6702AaroA生长速度最快。用不同剂量的野生株与缺失株分别通过肌肉

7、接种2日龄SPF雏鸡，测定其半数致死量(LD50)，结果显示，野生株S004、S005、S017和$6702的LD50分别为106·30、107040、106612和10834，而缺失株S004zlaroA、S005AaroA、S0173aroA和S6702AaroA的LD50分别为108卸、108256、108190和108‘57。可以看出，S004缺失株毒力显著降低，$6702缺失株毒力降低最少，但是其野生株毒力较其他野生株毒力也较弱。因此，aroA的缺失对鸡白痢沙门菌的致弱作用与菌株有关。鸡白痢沙门菌aroA致弱株的构建为疫苗候选株

8、的筛选奠定了基础。关键词：鸡白痢沙门菌，多重PCR，aroA基因，九RED同源重组，缺失株杨林：沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建DevelopmentofaMu