探索鸡白痢沙门氏菌分离株耐药性

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1、探索鸡白痢沙门氏菌分离株的耐药性1材料1.1菌株2007年从江苏省东台及周边地区疑似鸡白痢的病死鸡中分离鉴定的33株鸡白痢沙门氏菌，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离和保存。代写硕士论文英语硕士论文1.2培养基LB培养基（tryptone10g，yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH7.2）购自Oxoid公司。琼脂粉为中国医药（集团）上海化学试剂公司产品。1.3主要试剂ExTaq、DNAFragmentPurificationKit、AgaroseGelDNAPuri

2、ficationKit、MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKit、DNAmarker购自大连TaKaRa公司；PCR试剂盒、dNTP购自Promega公司；Ampicillin、IPTG、X-gal购自Roche公司（德国）；Tryptone、Yeastextract为Oxoid产品；NaAc、SDS、EDTA购自Sigma公司；质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品；克隆载体为pGEM-TeasyVector，购自Promega公司；15种药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

3、其它常规试剂均为国产分析纯级产品。DNA测序工作由上海联合基因科技有限公司完成。2方法2.1药敏试验及多重耐药析琼脂纸片扩散法(Kirby-Bauer，K-B），从孵育了16-24h的LB琼脂平板上，挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在LB培养基表面涂布接种，将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。纸片一旦与平板接触，不应再移动。37℃孵育18~20h以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，按药敏纸片制造商给出的抑菌标准进行结果判定。2.2磺胺类耐药菌株耐药基因的扩增与序列

4、测定根据沙门氏菌耐药的表型，选取针对两种磺胺类药物均产生耐药性的菌株作为试验菌株。2.2.1模板的制备细菌DNA模板的制备按全菌裂解法进行，取适量20h细菌培养物离心，沉淀用灭菌超纯水悬浮，使细菌浓度约为3×109CFU/mL；100℃水浴10min，置于冰浴中冷却；4℃10000rpm离心10min，取上清1μL作为PCR模板。2.2.2PCR引物设计与合成根据发表的序列，设计了3对引物，分别扩增磺胺类耐药基因sul1、sul2和I类整合子。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。2.2.3PCR反应用来扩增耐药

5、基因和整合子的PCR扩增体系为：在总量为25μL的反应体系中加1.0μM上游和下游引物（引物浓度为20μM），1×Taq聚合酶缓冲液，1.5mMMgCl2，200μMdNTP（dATP，dCTP，dGTP和dTTP），0.025U/μLTaq聚合酶（或ExTaq用于扩增Ⅰ类整合子），大约1μg模板DNA，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应参数如下：sul1-F/R为94°C5min，然后94℃30s，52℃30s，72℃60s，30个循环，72℃延伸7min；sul2-F/R为94°C5min，然后94℃，30s，

6、55℃30s，72℃50s，30个循环，72℃延伸7min；Ⅰ类整合子5’CS/3’CS采用递减PCR（TouchDownPCR），94℃5min预变性，94℃45s，61℃（每个循环降低1℃）45s，72℃90s，5个循环；94℃45s，56℃45s，72℃90s，共30个循环，72℃延伸10min。循环结束后，取PCR反应产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。2.2.4耐药基因的克隆将50μLPCR产物用TakaraDNAFragmentPurificationKit纯化回收，最后溶解到25μL灭菌超纯水中。按以

7、下体系建立T-A连接：取2×Rapidligationbuffer5μL，依次加入pGEM-TeasyVector1μL，PCR产物3μL，T4DNAligase1μL，混匀后室温连接6h或4℃过夜。取5μL连接产物（DNA<50ng）转化200μL感受态细菌，挑选单个白色菌落，碱裂解法小提质粒，根据酶切鉴定结果，将阳性克隆送上海联合基因科技有限公司进行DNA序列测定。通过NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）中的BLASTn搜索进行DNA的同源比较。3结果3

8、.1鸡白痢沙门氏菌的耐药性33株鸡白痢沙门氏菌的药敏试验显示丁胺卡那、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、氟苯尼考的抑菌作用较强，所有受试菌株均对其敏感；氯霉素、新霉素、恩诺沙星和羧苄青霉素次之，高敏菌株的比例分别为94%、91%、61%和58%；而四环素、复方磺胺、磺胺异恶唑的抑菌作用较差，耐药菌株的比例分别为88%、64%和61%；对于头孢噻肟和氨苄青霉素来说