鸡沙门氏菌病检测方法的建立及初步应用.pdf

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1、分类号：密级：公开学号：2015201702单位代码：10759石河子大学硕士学位论文鸡沙门氏菌病检测方法的建立及初步应用学位申请人刘志科指导教师陈创夫教授石峰副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月EstablishmentandApplicationfordeterminationoftheChickenSalmonellosisADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheReq

2、uirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLIUZhi-ke(Basicveterinaryscience)DissertationSupervisor:Prof.CHENChuang-fuJune,2018学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保

3、留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日中文摘要鸡沙门氏菌病由一种或多种血清型沙门氏菌引起鸡最常见的一种传染病，根据抗原结构主要分为鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒，严重威胁着养禽业的发展。为此，针对该病研制出快速、特异、灵敏高的检测方法迫在眉睫。本课题主要开展的研究工作如下：目的：（1）了解新疆北疆

4、部分地区大型种鸡场鸡沙门氏菌病主要流行血清型和耐药情况。（2）以鸡沙门氏菌特异性靶基因invA为诊断标记物，基于分子生物学方法和免疫胶体金技术，建立了鸡沙门氏菌套式PCR方法、环介导等温扩增联合横向侧流试纸（LAMP-LFD）方法和免疫胶体金试纸条，并对该方法的检测效果进行评价。方法：（1）采用平板凝集试验对新疆北疆部分地区大型种鸡场采集的750份临床样品进行检测，并对疑似鸡沙门氏菌病的病鸡进行细菌的分离鉴定、血清型鉴定和病理剖检方法。最后,用PCR方法进行确诊，并对分离的鸡沙门氏菌进行耐药性检测。（2）根据鸡沙门氏菌侵袭蛋白invA基因，设计两对特异性引物，

5、分别作为外引物和内引物；以第一轮PCR的产物作为第二轮PCR反应的模板，建立鸡沙门氏菌病套式PCR方法，同时进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。（3）依据鸡沙门氏菌侵袭蛋白invA高度保守局域，设计一套LAMP特异性引物和探针，优化LAMP反应体系和反应条件，将生物素标记的LAMP产物与地高辛标记的探针进行特异性杂交，并使用LFD完成检测。用细菌分离鉴定方法、常规PCR方法和建立的LAMP-LFD方法分别对鸡沙门氏菌污染的鸡蛋模拟样品和临床样品进行检测。（4）克隆鸡沙门氏菌invA基因并进行原核表达，用Ni-NTA纯化InvA融合蛋白，Westernblo

6、tting和ELISA鉴定该蛋白的反应原性；以InvA重组蛋白作为包被抗原，对反应条件进行优化，制备出免疫胶体金试纸条。用平板凝集试验和制备的免疫胶体金试纸条对鸡沙门氏菌病阳性血清和临床样本进行对比检测。结果：（1）该地区鸡沙门氏菌的分离率为9.2%，血清型诊断为D1型；该分离的鸡沙门氏菌对万古霉素和新霉素耐药性最高，分别为100.0%和81.2%，其中对氧氟沙星的耐药率最低，为4.62%，其次是头孢曲松、阿奇霉素和多西环素，耐药率分别为5.8%、8.7%和13.0%。（2）套式PCR方法最优反应体系和条件为：上下游引物用量分别为0.3μL，第一次退火温度为5

7、7.4℃，第二次退火温度为53.5℃。该套式PCR方法对重组质粒标准品的检测灵敏性为102拷贝数/μL，是常规PCR方法的1000倍，与细菌分离鉴定方法的符合率为91.67%。（3）LMAP-LFD方法最佳反应条件为62℃，50min内就可以完成检测；该方法对鸡沙门氏菌invA基因组DNA检测的敏感性为1.0×102CFU/mL，是常规PCR检测方法的1000倍。对人工污染鸡沙门氏菌的鸡蛋样品，其最低可以检测到初始感染量的9CFU/10mL；该方法对临床样品的检出率与细菌分离鉴定方法检测的符合率为95.14%。（4）胶体金最佳标记的pH值为7.6，抗体浓度为1

8、.7mg/mL；该免疫胶体金试纸条最高