犬狂犬病抗体直接竞争elisa检测方法的建立及初步应用

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1、犬狂犬病抗体直接竞争ELISA检测方法的建立及初步应用Development&PreliminaryApplicationofDirectCompetitiveELISAforMonitoringRabiesAntibodyinCanine作者姓名：任严新领域（方向）：兽医指导教师：张茂林副教授类别：兽医硕士答辩日期：2015年6月2日本研究由国家自然科学基金（项目编号：31272579）资助ThisresearchwassupportedbytheGrantsNo.31272579fromNationalNaturalScienceFoundationofC

2、hina.摘要狂犬病是由弹状病毒科、狂犬病病毒属的狂犬病病毒（RABV）引起的一种人兽共患病毒病，患病动物和人常出现严重的脑脊髓炎症状，一旦发病，死亡率接近100%。全世界每年因感染狂犬病死亡的人数约6万人，其中绝大部分发生在非洲和亚洲。狂犬病的自然宿主范围很广，几乎所有的温血动物均可感染此病。犬是我国狂犬病毒最主要的贮藏宿主和传播媒介，95%以上的人狂犬病是通过患病犬咬伤或者舔舐破损皮肤而引起。世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）认为体内中和抗体水平≥0.5IU/mL时，机体能抵抗该病的感染。动物免疫覆盖率达到70%时，可有效控制狂犬病的传播。

3、因此在狂犬病控制过程中，通过提高犬狂犬疫苗免疫覆盖率并结合抗体监测，可有效防止免疫失败及漏免现象，这对于控制我国狂犬病的流行传播有着十分重要的意义。目前WHO和OIE推荐的中和抗体检测方法分别为快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和荧光抗体病毒中和试验（FAVN）。虽然这两种方法能够对体内中和抗体准确定量，但都需要操作强毒和细胞，还需一定的仪器设备，对血清的质量要求也较高，且试验周期较长，不适于大规模的样品检测。酶联免疫吸附试验（ELISA）通过酶催化底物的颜色变化来指示抗原抗体反应，不仅可以避免上述两种方法的弊端，而且可以实现对样品的大批量快速检测。辣根过氧化物

4、酶（HRP）因其分子量小，对化学修饰的稳定性好等优势，成为ELISA中最常用的标记酶。本试验拟通过硫酸铵沉淀和ProteinA亲和层析法提取犬高免血清中的抗狂犬病毒IgG抗体，并经PAGE电泳鉴定纯度后，采用过碘酸钠氧化法标记HRP，将此酶标抗体作为竞争抗体，采用直接竞争ELISA法（c-ELISA）测定血清样品中的抗体效价，以此来避免间接ELISA法在大规模抗体检测中存在的非特异性。犬抗狂犬病病毒IgG抗体纯化。本实验中，采用改进的硫酸铵沉淀法提取犬高免血清中抗狂犬病病毒IgG抗体，经ProteinA亲和层析法精纯后，用SDS-PAGE和ELISA检测纯化抗

5、体的纯度和活性。经检测，硫酸铵沉淀纯化后的抗体回收率为96%，抗体效价约为82923×10，ProteinA亲和层析的抗体效价约为3×10。纯化抗体的HRP标记及其工作浓度筛选。应用过碘酸钠氧化法将HRP标记到纯化IgG上，经45%硫酸铵沉淀收获酶标记抗体。经紫外分光光度法检测发现，酶标抗体中的酶结合率为39%。通过方阵法确定的ELISA最适反应条件为：最佳抗原包被浓度为50μg/mL，酶标抗体最佳稀释度为1:1000。应用犬易感的几种病原包被，发现所制酶标抗体与它们均无I交叉反应性。ELISA检测抗体标准曲线的建立。将标准阳性血清二倍倍比稀释后，采用c-EL

6、ISA法测血清抗体效价和吸光度标准曲线，得到的线性回归方程为Y=－6.387X＋5.617，决定系数2为R=0.940。确定该方法的敏感度为0.25IU/mL，检测范围为0.25-4IU/mL。采用该方法测定血清样品中抗体滴度，并与FAVN法对比，发现两者所得结果无显著性差异（P=0.092，P＞0.05）。精密性检测发现，平均板内变异系数为4.76%，平均板间变异系数为5.89%。关键词：狂犬病，IgG，抗体检测，辣根过氧化物酶，直接竞争ELISAIIAbstractRabiesvirus（RABV）isthetypicalmemberofthezoonot

7、icviruses,belongingtogenusLyssavirusoffamilyRhabdoviridaewhichisresponsibleforfatalencephalitisinanimalsandhumans.Oncethesymptomsstartappearing,themortalityrateisalmost100%.Over60,000humandeathsoccurglobally,mostofwhichinAfricaandAsia.Almostallwarm-bloodedanimalscanbeinfectedbyrabie

8、svirus.However,stra