猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立及其初步应用

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HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY硕士学位论文MASTER’SDEGREEDISSERTATION猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立及初步应用DEVELOPMENTANDPRELIMINARYAPPLICATIONOFELISAFORDETECTIONOFANTIBODYAGAINSTPORCINEEPIDEMICDIARRHEA研究生:丁振江CANDIDATE:DINGZHENJIANG导师:何启盖教授汤细彪博士SUPERVISOR:PROFESSORHEQIGAIDOCTORTANGXIBIAO专业:兽医硕士MAJOR:MASTEROFVETERINARYMEDICINE研究方向:FIELD:中国武汉WUHAN，CHINA二○一四年六月JUNE，2014万方数据 分类号密级华中农业大学硕士学位论文猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立及其初步应用DEVELOPMENTANDPRELIMINARYAPPLICATIONOFELISAFORDETECTIONOFANTIBODYAGAINSTPORCINEEPIDEMICDIARRHEAVIRUS硕士研究生:丁振江学号:2012302120028指导教师:何启盖教授指导小组:陈焕春院士吴斌教授孟宪荣讲师陈品讲师学位类型：兽医硕士华中农业大学动物科技学院-动物医学院中国·武汉CollegeofAnimalSciencesandTechnologyHuazhongAgriculturalUniversityWuhan,China万方数据 万方数据 本论文受到下述项目资助国家自然科学基金项目（31272572）国家生猪产业技术体系（CARS-36）万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用目录摘要..........................................................................................................................i缩略语表(Abbreviation)..............................................................................................v1.前言......................................................................................................................11.1猪流行性腹泻概述.......................................................................................11.1.1病毒的发现.......................................................................................11.1.2流行病学...........................................................................................11.1.3临床症状...........................................................................................31.1.4病理变化...........................................................................................31.1.5致病机理...........................................................................................41.2PEDV的分子生物学特征.............................................................................51.2.1PEDV基因组结构............................................................................51.2.2S基因和S蛋白................................................................................61.2.3E基因和E蛋白..............................................................................71.2.4M基因和M蛋白.............................................................................71.2.5N基因和N蛋白...............................................................................71.2.6ORF3基因及其功能........................................................................81.3PED疫苗的研究进展.................................................................................81.3.1灭活疫苗.............................................................................................81.3.2活疫苗.................................................................................................81.3.3基因工程疫苗.....................................................................................91.4黏膜免疫.....................................................................................................101.5诊断方法的研究概况.................................................................................101.5.1病毒的分离鉴定...............................................................................101.5.2免疫电镜法.......................................................................................111.5.3血清中和试验...................................................................................111.5.4免疫荧光方法...................................................................................111.5.5酶联免疫吸附试验...........................................................................121.5.6聚合酶链式反应...............................................................................121.6研究目的与意义.........................................................................................132.猪流行性腹泻S1D蛋白的表达、纯化与活性鉴定.........................................142.1材料.............................................................................................................142.1.1质粒和菌株.......................................................................................14I万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文2.1.2试验器材............................................................................................142.1.3主要培养基及缓冲液的配制.............................................................142.2试验方法......................................................................................................152.2.1目的蛋白在大肠杆菌中表达..........................................................152.2.2SDS-PAGE分析..............................................................................162.2.3Westernblot分析.............................................................................172.2.4原核表达产物的提取......................................................................172.3试验结果......................................................................................................182.3.1S1D蛋白的SDS-PAGE结果............................................................182.3.2S1D蛋白的Westernblot分析...........................................................182.3.3蛋白浓度的测定................................................................................192.4小结与讨论..................................................................................................193.猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立....................................203.1材料...............................................................................................................203.1.1主要试剂和仪器.................................................................................203.1.2ELISA相关试剂的配制.....................................................................203.2试验方法.......................................................................................................203.2.1待检材料的预处理............................................................................203.2.2免疫荧光试验检测乳汁中的IgA抗体............................................203.2.3抗原最佳包被浓度和乳汁稀释度的选择.........................................213.2.4抗原最佳包被时间的选择................................................................213.2.5最佳封闭液的选择.............................................................................213.2.6最佳封闭时间的选择........................................................................223.2.7最佳一抗作用时间的选择................................................................223.2.8最佳酶标抗体作用时间的选择........................................................223.2.9阴阳性临界值的确定........................................................................223.2.10重复试验..........................................................................................223.2.11敏感性试验.......................................................................................233.2.12比较试验..........................................................................................233.2.13母猪乳汁IgA抗体水平与仔猪腹泻关系的评估..........................233.3.14疫苗免疫后IgA抗体对比试验......................................................233.3结果与分析...................................................................................................243.3.1免疫荧光试验检测乳汁中的IgA抗体............................................243.3.2抗原最佳包被浓度和乳汁稀释度.....................................................24II万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用3.3.3最佳抗原包被条件...........................................................................253.3.4最佳封闭液.......................................................................................253.3.5最佳封闭时间...................................................................................263.3.6最佳乳汁作用时间...........................................................................263.3.7最佳酶标抗体作用时间...................................................................263.3.8阴阳性临界值...................................................................................273.3.9重复性试验.......................................................................................273.3.10敏感性试验.....................................................................................283.3.11比较试验.........................................................................................293.3.12乳汁IgA抗体水平与仔猪腹泻关系的评估.................................303.3.13疫苗免疫后IgA抗体对比试验.....................................................313.4小结与讨论..................................................................................................314.猪流行性腹泻IgG抗体间接ELISA检测方法的建立....................................334.1材料..............................................................................................................334.1.1主要试剂和仪器................................................................................334.1.2ELISA相关试剂的配制....................................................................334.2试验方法......................................................................................................334.2.1免疫荧光试验检测阳性血清中的IgG抗体....................................334.2.2抗原最佳包被浓度和血清稀释度的选择........................................334.2.3抗原最佳包被时间的选择...............................................................344.2.4最佳封闭液的选择............................................................................344.2.5最佳封闭时间的选择.......................................................................344.2.6最佳一抗作用时间的选择...............................................................344.2.7最佳酶标抗体作用时间的选择.......................................................354.2.8临界值的确定...................................................................................354.2.9重复试验...........................................................................................354.2.10疫苗免疫对比试验..........................................................................354.2.11哺乳仔猪猪流行性腹泻IgG抗体的变化......................................364.3结果与分析..................................................................................................364.3.1免疫荧光试验检测阳性血清中的IgG抗体....................................364.3.2抗原最佳包被浓度和血清稀释度....................................................364.3.3最佳抗原包被条件............................................................................374.3.4最佳封闭液.......................................................................................374.3.5最佳封闭时间....................................................................................38III万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文4.3.6最佳血清作用时间............................................................................384.3.7最佳酶标抗体作用时间....................................................................394.3.8阴阳性临界值....................................................................................394.3.9重复性试验........................................................................................394.3.10疫苗免疫对比试验...........................................................................404.3.11哺乳仔猪猪流行性腹泻IgG抗体的变化......................................414.4小结与讨论...................................................................................................425.全文结论...............................................................................................................43参考文献....................................................................................................................44致谢..........................................................................................................................50IV万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用摘要猪流行性腹泻病原为冠状病毒科的猪流行性腹泻病毒。本病主要发病于气温比较寒冷的冬春季节，猪群中的传播速度快，不同年龄阶段的猪只均容易感染，主要引起日龄较小哺乳仔猪腹泻的高发病率和高死亡率，有时1~3日龄仔猪的死亡率可以达到100%。主要临床表现为仔猪的呕吐、腹泻、脱水、饮欲增加和精神萎靡等。解剖病变主要在胃肠道，表现为胃内凝集有未消化的乳块，小肠肠壁菲薄，充盈，内部充满气体，有时可见肠系膜淋巴结充血肿胀。耐过仔猪成为僵猪，饲料利用率低，并可长期带毒，有向环境中排出病毒的风险。近年来，PED在我国的流行区域进一步的扩大，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。PED已经成为全球养猪业最为关注的的重要疾病之一。抗体检测可用于感染诊断和免疫效果评估，目前已经报道的猪流行性腹泻IgG抗体检测试剂盒主要是采用全病毒包被抗原的方法，在临床应用时存在潜在散毒的危险；未见国内有检测母猪乳汁中猪流行性腹泻IgA抗体方法的报道。本研究使用猪流行性腹泻重组S1D蛋白作为包被抗原建立了猪流行性腹泻血清IgG和乳汁IgA抗体的检测方法。现报告如下：一、猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的表达与纯化猪流行性腹泻病毒S1D区（636~798aa）位于S蛋白的S1亚基，该位点携带了PEDV主要的B细胞抗原表位。利用本实验室前期构建的猪流行性腹泻病毒S1D基因表达质粒pET-28a-S1D转化大肠杆菌表达菌株BL21，成功表达了猪流行性腹泻病毒的S1D蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达的S1D重组蛋白主要存在于沉淀中，大小为35KDa。Westernblot试验显示，纯化后的S1D重组蛋白与猪流行性腹泻阳性多抗产生了显著的特异反应，表明本试验获得的蛋白针对PEDV抗体的反应原性较好，可以用于PEDV抗体ELISA检测方法的研究。二、猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测方法利用纯化的S1D蛋白作为包被抗原，通过反应条件的优化，确定了母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的最佳反应条件：S1D蛋白稀释至1µg/mL，于37℃孵育60min后，4℃包被过夜。每孔加入200µL5%的脱脂奶粉，37℃封闭60min，乳清10倍稀释，100µL/每孔置于37℃反应60min，酶标二抗（1:10000稀释）100µL/孔37℃反应45min。加入底物避光显色10min后测定OD630nm值。用本试验方法与韩国BIONOTE公司生产的IgA抗体检测试剂盒对比检测，本试验方法IgA抗体检测敏感度为96.5%，特异度为82.1%，两种方法的总符合率为93.82%，表明本研究建立的IgA抗体检测方法具有较高的敏感性及特异性。i万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文三、猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测方法猪流行性腹泻病毒IgG抗体间接ELISA检测方法最佳反应条件：S1D蛋白稀释至2µg/mL，于37℃孵育60min，4℃包被过夜。2%的脱脂奶粉每孔200µL，37℃封闭60min，待检血清40倍稀释后，100µL/每孔于37℃反应60min，酶标二抗（1:6000稀释）100µL/孔37℃反应45min。加入底物避光显色10min后测定OD630nm值。关键词：猪流行性腹泻病毒；S1D蛋白；IgA抗体；IgG抗体；ELSIAii万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用ABSTRACTThepathogenofporcineepidemicdiarrheabelongstothecoronavirusfamily.Themainseasonalincidenceofthediseaseisinwinterandspringwhenthetemperatureislow.PEDVspreadrapidlyinthepigfarms.Pigsofallagesaresusceptible,leadingthehighmorbidityandhighmortalityofpiglets.Themortalityof1to3-day-oldpigletcouldbeupto100%.Themainclinicalmanifestationsofpigletsarevomiting,diarrhea,dehydration,increaseddesirefordrinkandapathetic.Anatomicallesionsaremainlyobservedinthegastrointestinaltract.Thestomachisfilledwithcurd.Thesmallintestinefillswithgasandintestinalwallbecomesthin.Sometimes,mesentericlymphiscongestionandswelling.ThehealedpigletsthatoncesufferedfromPEDwillbecomestiffpigandlong-termcarriersofthevirus.Theyhaveriskofventingvirusestotheenvironment.Recently,endemicareasofPEDarecontinuestoexpand.PEDhasbecomeoneofthemostharmfuldiseasesofglobalpigindustrycausingenormouseconomiclosses.Antibodydetectioncanbeusedforinfectiondiagnosticandimmuneeffectassessment.Nowadays，thekitsforPEDVIgGantibodiesdetectionaremainlycoatedbythewholevirus,whichwouldpotentialdischargeviruses.AsfarasIknow,norelevantsowmilkPEDVIgAantibodiesdetectionmethodshavebeenreportedinchina.ThisstudycouldlaythefoundationfortheclinicalassessmentofPEDVIgGandIgAantibodies.Detailmethodsareasfollows:1.ExpressionandpurificationofporcineepidemicdiarrheaS1DproteinS1Dregion(636~798aa)ofporcineepidemicdiarrheavirusislocatedintheS1subunitofSprotein.ThefragmentcarriestwomainBcellantigenepitopesofPEDV.TherecombinantplasmidpET-28a-S1DwastransformedintoE.colistrainBL21andthePEDV-S1Dproteinwasexpressedsuccessfully.SDS-PAGEanalysisshowedthatthe35KDarecombinantS1Dproteinwasmainlyexpressedininclusionbody.WesternblotexperimentsdemonstratedthatthepurifiedS1DrecombinantproteinhadsignificantspecificreactionwiththepositiveserumofPEDV.TheresultindicatedthattheproteinhasgoodreactionogenicityagainstPEDVantibodiesandcanbeusedinthestudyofPEDVantibodyELISAdetectionmethod.2.TheestablishmentofporcineepidemicdiarrheaIgAantibodydetectionmethodThepurifiedS1Drecombinantproteinwasusedascoatingantigen.WeestablishedtheoptimumreactionconditionsofPEDVIgAantibodyindirectELISAmethod:S1Dproteinisdilutedto1µg/mL,incubatedfor60minat37℃,Incubateovernightat4℃.Blockingbufferwas5%skimmedmilkpowder,200µLperholeincubatefor60minatiii万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文37℃.Wheywas10timesdilution,100µLperholeincubatefor60minat37℃,HRP-IgGsecondaryantibody（1:10000dilution）100µLperholeincubatefor45minat37℃.Thesubstratewasincubatedfor10minindarkandthenmeasuredatOD630nm.Ourmethodhad96.5%sensitivityand82.1%specificitycomparedtoIgAantibodydetectionkitofBIONOTE.Thecoincidencerateoftwomethodswas93.82%,showingourmethodhadgoodsensitivityandspecificity.3.TheestablishmentofporcineepidemicdiarrheavirusIgGantibodydetectionmethodTheoptimumreactionconditionsofPEDVIgGantibodyindirectELISAmethodareasfollows:S1Dproteinisdilutedto2µg/mL,incubatedat37℃for60min,then4℃coatedovernight.Blockingbufferwas2%skimmedmilkpowder,200µLperholeincubatedfor60minat37℃.Theserumwas40timesdilution,100µLperholeincubatedfor60minat37℃,HRP-IgGsecondaryantibody（1:6000dilution）100µLperholeincubatedfor45minat37℃.Thesubstratewasincubatedfor10minindarkandthenmeasuredatOD630nm.Keywords：Porcineepidemicdiarrheavirus；ProteinS1D；ImmunoglobulinG；ImmunoglobulinA；ELISAiv万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用缩略语表(Abbreviation)英文缩写英文全称中文名称bpbasepair碱基对dday天DAB3，3’-Diaminobenzidine3，3’-二氨基联苯胺DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPdeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbentAssays酶联免疫吸附试验FgFemtogram毫微微克ggram克hhour小时HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IgAImmunoglobulinA免疫球蛋白AIgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GLliter升LBlauriabrothLB培养基mminute分钟MEMminimumessentialmediumMEM培养基mgmilligram，毫克mLmilliliter毫升ORFopenreadingframe开放读码框PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液r/minrotationperminute每分钟转速RNAribonucleicacid核糖核酸RT-PCRreverasetranscriptionpolymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应ssecond秒TGEVtransmissiblegastroenteritisvirus猪传染性胃肠炎病毒µgmicrogram微克µLmicroliter微升v万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用1.前言PEDV属于Ⅰ型冠状病毒属，主要引起哺乳仔猪腹泻，各个年龄段的猪群均易感。哺乳仔猪于1~7日龄发病，主要临床特征为水样腹泻，呕吐，脱水等，发病率和死亡率高。在母猪群和育肥猪群中主要表现为一过性腹泻，发病率和死亡率低，但痊愈后可长期带毒，并有持续向环境中排毒的危险。我国猪群中的PED主要在冬春温度较低的季节多发，但夏秋等温度较高的季节也有PED造成的腹泻病例出现。我国的免疫猪群中仍然有部分猪场存在PED的流行，给猪病的防治带来了新的挑战。目前美国已经报道猪流行性腹泻的爆发流行，该病已经因为严重危害全球养猪业而被世界各国所关注。1.1猪流行性腹泻概述1.1.1病毒的发现1971年，猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea）在英国的英格兰地区首次爆发，主要发生在育肥猪群中，初生仔猪不表现发病，临床表现与TGE相似，以水样腹泻为主要的临床表现。经过研究发现，该病毒不同于常见的猪肠道传染性腹泻病毒，也排除了TGEV的可能。随后，该病在欧洲逐渐蔓延开来，被称为“流行性病毒型腹泻”（EDV）（Anonymous，1972）。1976年wood等人发现，在包括仔猪群在内的各个年龄段的猪群均爆发了类似TGE临床症状的腹泻，并且排除了TGE病原及其他已知的肠道致病性病原。由于该病在仔猪群中也发病，为了区分与1971年腹泻病毒的不同，将该病毒命名为EDV2，前者命名为EVD1（wood，1977）。1977年，比利时4个繁育场各年龄段猪只同时爆发水样腹泻，总死亡率接近50%。母猪的临床症状相似，一般表现为一过性的腹泻，3~4天基本痊愈。将患病仔猪的小肠冰冻切片处理，间接免疫荧光（IFA）检测TGEV阴性。将腹泻病料处理后饲喂1日龄未吃初乳的仔猪，发生严重的水样腹泻，30小时后死亡。电镜扫描发现该腹泻病毒为冠状病毒，将该病毒命名为CV777（PensaertMB和DeBouckP）。随后对仔猪和育肥猪接种CV777毒株，均表现出了腹泻症状。因为EDV1和EDV2引起的腹泻都是由该类型的冠状病毒引起，所以将此腹泻病毒统称为“猪流行性腹泻病毒”（Pensaert等，1982），并沿用至今。1.1.2流行病学1982~1990年间，在欧洲的英国，德国，比利时，瑞士，法国，荷兰等地的猪1万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文群中均检测到了PEDV抗体（DeBouckP等，1982），但此后PED的爆发病例逐渐减少，关于PEDV的流行病学报道也比较少见。与欧洲目前的情况不同，亚洲地区PED的流行情况日益严峻，猪群因腹泻造成的死亡率居高不下。1983年，日本境内首次出现猪流行性腹泻的报道。1993~1994年爆发的PED造成了约14000头猪只因腹泻而死亡，其中仔猪的死亡率为30%~100%，产仔母猪表现为泌乳量降低，食欲下降。在一次PED大爆发中，日本因腹泻死亡仔猪达30万头，给养猪业造成了巨大损失。韩国1992年首次出现PED的报道，1992~1993年期间，韩国某兽医研究所检出的71份病毒性腹泻病料中，PED的检出率为56.3%。1994年韩国对来自7个地区生猪屠宰场的469份血清样品进行了抗体调查，45%的血清样品呈PEDV抗体阳性。1997~1999年，韩国从5个省份搜集了1258份腹泻病料，50.4%确诊为PEDV阳性。泰国1995年首次报道PEDV在其南部地区爆发（Srinuntapuntetal,1995），PED爆发初期并未传播到泰国的其地区。2007年年底，PED在泰国养殖密度较高的NakornPathom省再次出现，并传播到其他地区，对泰国商品猪养殖企业造成了巨大损失(Puranavejaetal,2009)。中国在1973年出现类似TGE的急性传染性腹泻，该腹泻病原于1984年经免疫荧光试验和微量血清中和试验证明是PEDV（宣华等，1984）。1990年崔现兰等采用间接免疫荧光法对PED阳性猪场采集的血清进行检测，结果PEDV抗体阳性率为89%(89/100)，对屠宰场血清PEDV抗体检测发现阳性率为25.2%(61/202)。2006年，杨群等对我国10个省份送检的158份粪样用多重RT-PCR方法检测，PEDV的检出率为53.2%，表明我国猪场普遍存在PEDV的感染。2009年，田小艳等应用RT-PCR检测方法对广东省规模化猪场95份疑似PED的腹泻样品进行检测，发现其中32份为PEDV阳性，阳性率33.7%（田小艳等，2009）。2010年底，我国部分省份相继暴发猪流行性腹泻，发病率为40%~100%，7日龄以内仔猪的死亡率高达50%~100%，给我国养猪行业带来严重经济损失。2010年本实验室张坤等应用RT-PCR方法对华中地区75份送检腹泻粪样进行检测，PEDV的阳性率达33.3%(张坤等，2010)。2011年1月到10月，本实验室李文涛等收集来自中国12个省份57个猪场的455份腹泻样品，RT-PCR检测结果显示，45%的猪场至少检出1例PEDV阳性。61.1%（278/455）的样品检出PEDV阳性。粪样，肠管，乳汁样品中PEDV阳性率分别为62.94%（253/402），64.52%（20/31）和22.73%（5/22），随后选取来自9个腹泻发病率和死亡率高的猪场样品进行S基因全长测序分析，结果发现经典毒株和变异毒株同时存在，提示不同毒株在我国猪场中可能呈多样分布，S基因序列的插入和突变可能导致变异毒株的毒力和致病性增强，并影响经典疫苗（CV777毒株）的保护力，最终造成2011年猪流行性腹泻在我国猪场中的爆发和流行（LiWTetal，2012）。2011年2月到2012年3月，董彦鹏等检测收集来自华东地区10个省份47个规模化养猪场的153份腹泻样品，发现其中262万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用个猪场的88份腹泻样品检出PEDV阳性，猪场阳性率为55.32%，病料阳性率为57.52%，对11个流行病毒株的ORF3全基因序列分析表明，我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异（董彦鹏等，2013）。林裕胜等采集福建省62个规模猪场的128份腹泻病料进行腹泻病毒检测，发现PEDV的阳性率为67.97%（87/128），PEDV和TGEV混合感染率为19.53%（25/128）。美国于2013年4月首次报道猪流行性腹泻的爆发，截止同年10月PEDV疫情迅速传播至18个州，主要特征为腹泻仔猪的高死亡率，造成了巨大的经济损失(Huangetal.,Hoangetal.)。猪流行性腹泻主要在寒冷天气多发，粪-口途径是最主要的传播途径，但并不是唯一的途径。母猪的乳汁中可以检出PEDV，哺乳仔猪可通过吮吸乳汁而感染（Sunetal,2012），引起PED的垂直传播。带毒猪是猪场PEDV的主要传染源，病毒随粪便排除后污染运输工具，饲料，饮水等，也可通过人、鼠等传播媒介传播。1.1.3临床症状PED主要的临床症状为1周龄以内哺乳仔猪感染后的水样腹泻。不同地区的易感猪群仔猪的发病率和死亡率差别较大，发病率可达100%，死亡率可达30%~100%；各个年龄阶段的的猪群均可感染，母猪和架子猪主要表现为一过性腹泻，发病率较仔猪低，一般不发生死亡，一周左右可自行痊愈。该病主要侵害1~3日龄的哺乳仔猪，仔猪最早出生后12h~24h即可发生腹泻，腹泻仔猪主要表现为腹泻，厌食，脱水，眼眶凹陷，饮欲增加，呕吐，被毛粗乱，精神沉郁，体温先升高后降低。哺乳仔猪一般在发病2~4d后因脱水而死亡，日龄比较大的仔猪可耐过，形成僵猪。目前，PED和同属于冠状病毒的TGE在临床症状上极其相似，二者可同时感染，通过一般的临床剖检难以分辨，需借助实验室病原诊断。1.1.4病理变化PED的病变区域局限在仔猪的小肠，主要以肠内卡他性病变为特征。解剖新死亡仔猪可见仔猪皮下脂肪变薄，胃内有未消化的凝乳块，呈黄白色，胃壁有时可见充血。肠道因充满气体而充盈，肠壁透明状，菲薄，肠系膜淋淋巴结和腹股沟淋巴结肿胀、充血。其它器官未见明显的眼观病变（O.KimandC.Chae，2000；FrancoGuscettietal,1998；丁振江等，2013）。仔猪小肠的石蜡病理切片可见，肠绒毛变粗，缩短，肠绒毛上皮细胞呈现柱状或扁平状，有的细胞被脂肪滴占据而呈现空泡状，部分肠绒毛脱离肠壁，呈扁平状阳性上皮特征。电子显微镜观察可见变短的肠绒毛和肠腺比，从正常的7:1下降到3:1（邬良贤等，2000）。田欣田以透射电镜和扫描电镜分别观察了感染仔猪的小肠黏膜上皮细胞和肠系膜淋巴细胞的超威结构发现，3万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文仔猪的小肠上皮细胞的病理变化与因感染时间的不同而存在明显差异。仔猪感染病毒30h后上皮细胞内的病毒增殖最为显着，其超威结构的破坏和脱落也最为严重；感染后45h，出现大量的新生小肠上皮细胞修复受损或脱落的小肠绒毛；感染后96h，小肠绒毛缩短变粗，甚至发生融合。仔猪的肠系膜淋巴结内的巨噬细胞和淋巴细胞均遭到不同程度的破坏（田欣田等，1988）。O.Kim和C.Chae使用原位杂交技术检测10头自然感染猪的肠道组织，发现病毒仅存在于十二指肠，空肠和回肠。Debouck等应用免疫荧光抗体技术对人工感染猪流行性腹泻经典毒株仔猪的肠道进行检测，在十二指肠、空肠、回肠和结肠段检测到病原（Horvathetal.,1981）。主要在肠细胞胞浆中出现超威结构的变化，表现为细胞器的数量变少，末端网状结构及微绒毛消失，肠腔内出现部分胞浆成份，肠细胞扁平状，肠腔中出现脱落的紧密连接，由此可见内质网膜主要通过出芽方式生成病毒离子然后出现在肠细胞内（Ducatelleetal.,1981b）。1.1.5致病机理遇秀玲等将猪流行性腹泻病毒接种猪肠道原代细胞，发现胞浆空泡化，细胞核崩解破裂，线粒体明显肿胀变形，次级溶酶体增加，高尔基体膨大，微绒毛排列紊乱，断裂，脱落或消失，线粒体的破坏导致脂肪氧化不全和主动运输障碍，上皮细胞可以观察到阳性的脂肪颗粒。粗面内质网中增殖的病毒离子以出芽的方式进入肠道上皮细胞，并形成形态和大小不一的病毒包涵体，最后病毒离子通过细胞崩解或胞吐的方式释放（遇秀玲等，1985）。仔猪腹泻发生在小肠绒毛萎缩前，主要因为病毒在小肠上皮细胞内的增殖导致大量的细胞器超威结构的损伤，造成细胞功能的破坏或丧失，当线粒体肿胀变形，营养因能量不足而吸收不良。在细胞器损伤的同时，胞内酶活性也发生了相应的变化，薄清如和潘耀谦分别使用免疫组化方法和电镜方法证实了，受损的肠道细胞碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，琥珀酸脱氢酶，单胺氧化酶，ATP酶等均出现活性的降低或丧失（潘耀谦，1987；薄清如，1989），Coussemen等也报道了同样的结果(CoussmentW.etal,1982)。PED病毒在小肠细胞内增值，随着病情的发展，一方面病毒侵害小肠黏膜上皮细胞，使之崩解、断裂、脱落、绒毛裸露，从而影响消化、吸收；另一方面小肠黏膜上皮细胞内各种生物酶活性降低，从而阻碍肠腔内的小分子物质，如小分子糖、肽等的进一步分解、吸收，导致肠腔胶体渗透压升高，同时由于ATP酶活性降低或缺乏，小肠上皮细胞内的钠泵失活后导致机体晶体渗透压升高；最终导致仔猪发生渗透性腹泻，严重时仔猪因脱水、衰竭而死亡（张远钰，1992，）。经剖腹产、未吃初乳的仔猪在3日龄时口服感染经典分离毒株CV777，在感染4万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用后22h~36h后仔猪开始发病（DeBoucketal.,1981a;Fennestadetal.,1986）。对采集的小肠组织经过免疫荧光和透射电镜检测发现，PED病毒主要出现在仔猪小肠及结肠绒毛上皮细胞胞浆中，攻毒后12h~18h在感染仔猪的小肠上皮细胞中可以检测到PED病毒的存在，并且病毒含量在24h~36h达到峰值。病毒在小肠上皮细胞中的增殖造成了肠绒毛上皮细胞的变性，崩解，脱落。关于大猪体内PED的致病机理并不清楚，但是免疫荧光试验观察到自然感染和实验感染的育肥猪在小肠绒毛上皮细胞中均有荧光出现（DebouckP.和PensaertM.,1980）。1.2PEDV的分子生物学特征1.2.1PEDV基因组结构猪流行性腹泻病的基因组是有囊膜的，单股正链RNA，具有感染性；与其它的冠状病毒类似，其基因组5′端具有一个帽子结构(cap)，3′端有1个Poly(A)尾巴，基因组全长为28033nt（CV777株）。基因组的5′UTR在基因组的上游，片段长度296nt；5′UTR含有片段长为65～98nt的前导区和一个AUG起始密码子、编码12个氨基酸的开放阅读框架（openreadingframe,ORF）。3′UTR由8个碱基（GGAAGAGC）组成保守序列，起始于poly（A）尾上游的73nt处，冠状病毒一般都包含此序列，只是分布的位置有所不同（Duarteetal.，1993）；基因组的编码区序列包括6个开放式阅读框（ORFs），在其基因组5′端约三分之二的区域，由ORF1a（12354nt）和ORF1b（8037nt）两个阅读框分别编码病毒的RNA聚合酶蛋白；基因组的近3′端约三分之一区域包含4个主要的开放式阅读框，编码4个主要的结构蛋白，从5′端到3′端依次为S蛋白（spike），E蛋白(sM,smallmembrane)，M蛋白(membrane)，N蛋白(nucleocapsid)。ORF3基因位于sM基因的上游，主要负责编码非结构蛋白。PEDV基因组结构如图1所示。5万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文图1PEDV结构及基因组模式图（DaesubSongetal,2012）Fig.1StructureofthePEDVvirusandSchematicrepresentationofthePEDVgenomebasedontheCV777(GenBankaccessionNo.AF353511)strain1.2.2S基因和S蛋白PEDVS基因长4152bp，编码的S蛋白由1383个氨基酸组成，大小约180~220KDa，包括一个信号肽序列，一个跨膜区和一个较短的胞内区。预测S蛋白大约有27~30个潜在的糖基化位点，这些位点可能都存在重要的生物学意义(李建强等，2007)。S蛋白是位于病毒离子表面的纤突糖蛋白，其在PED病毒与细胞表面的受体结合及通过膜融合进入宿主细胞过程中发挥了重要生物学作用。S蛋白可以在宿主细胞内部介导中和抗体的产生（Yeoetal.,2003）。S蛋白可划分成3个结构域：较短的羧基末端结构域，较大的外部结构域及转膜结构域。S蛋白外部结构域包括与宿主细胞表面大分子结合的受体结合域以及介导中和抗体产生的抗原表位，羧基端的细胞质结构域主要由疏水的氨基酸组成，疏水区对S蛋白起到了固定作用（Duarteetal.,1994）。根据PEDVS蛋白保守区的基序将其划分为S1区（1～789aa）和S2区（790～1383aa）（CruzDJetal,2008）。PEDV的S2区比S1区更为保守，与其他冠状病毒基因序列同源性比较发现，S1区同源性为18%~21%，S2区同源性为34%~35%。S1区结构域参与特异性受体的识别和结合，结构域具有多样性，S2区结构域参与病毒离子与宿主细胞的膜融合，相对比较保守。S蛋白的COE区(499~638aa)是病毒重要的中和表位，能够诱导机体中和抗体的产生。S1蛋白的S1D区(636~789aa)包含一个线性抗原表位(697~742aa)和两个B细胞抗原表位，分别为744~759aa和756~771aa区域(SunDetal,2008)。这两个蛋白抗原区域是优秀的疫苗备选抗原，目前广泛用于PED疫苗的研发工作中。S基因是PEDV重要的毒力基因，不同毒株之间存在碱基的突变、缺失或插入，因此毒力不同。6万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用1.2.3E基因和E蛋白E基因长度为231bp，编码76个氨基酸的多肽，E蛋白的分子质量约为8.8KDa。E蛋白是病毒的膜蛋白，病毒的组装和出芽需要E蛋白的辅助。E基因的变异性较小，E蛋白在病毒中的含量很低，目前E蛋白的功能研究还较少。1.2.4M基因和M蛋白M基因编码226个氨基酸多肽，分子量为27KDa～32KDa。M基因全长681bp。M蛋白是PED病毒离子表面的跨膜蛋白，在病毒离子的组装过程中起关键的作用。M蛋白在病毒装配期间将核衣壳蛋白连接到囊膜上对病毒的成熟很重要(UtigerA,etal,1995)。抗M蛋白抗体在补体存在的条件下能中和PEDV的感染。M蛋白能刺激机体产生细胞免疫分泌α-IFN，因此M蛋白可以用于PEDV基因工程疫苗的研究（Utigeretal.,1993;Utigeretal.,1995）。高慎阳等研究发现体外表达的M蛋白可抑制大肠杆菌的繁殖，该功能主要通过破坏大肠杆菌的细胞膜结构或直接干扰转录过程使大肠杆菌发生凋亡(高慎阳等，2007)。PEDV与HCV229E、TGEVM基因的同源性分别为57%和53%。M基因比较保守，CV777和Brl/87核苷酸序列在M基因区域仅有一个核苷酸不同，因此一般的PEDV聚合酶链式反应引物是通过M基因设计的。1.2.5N基因和N蛋白N基因长1326bp，编码一个441个氨基酸多肽的N（nucleocapsid)蛋白，分子量为55KDa～58KDa。病毒核衣壳由N蛋白与基因组RNA相互缠绕构成，其中N蛋白起到支架作用。N蛋白在受感染细胞中能够大量表达，在病毒结构蛋白中含量最多，猪只在感染早期即可检出高水平的抗N蛋白的抗体(LeeHK，etal,2003)，因此N蛋白可以作为PEDV早期诊断的靶蛋白，并应用到基因工程疫苗的研制工作中。冠状病毒N蛋白是一种碱性蛋白，磷酸化程度很高，基因组RNA与N蛋白结合后形成螺旋状的核蛋白体。N蛋白在细胞质中与位于病毒颗粒核心部分的RNA结合，随后结合产物被M蛋白识别，被包装到病毒离子中。N蛋白在病毒RNA合成过程中具有重要作用，N蛋白与细胞膜和磷脂结合后可以促进RNA复制体的形成和病毒离子的组装（BridgenA,1993）。N蛋白在病毒离子成熟前在细胞中大量聚集，这可能与其mRNA含量最高有关（LaiMMC,1997）。7万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文1.2.6ORF3基因及其功能ORF3是PEDV的非结构基因，位于S基因下游116~784aa处，完整的ORF3基因共有675nt，编码223~224个氨基酸的多肽。ORF3基因和病毒的毒力相关(DuarteMetal，1994)，野生型毒株和致弱毒株测序比较发现后者有17个氨基酸的缺失，推测该缺失是和病毒致病性密切相关的基因位点；同时根据野毒株和疫苗毒株ORF3的序列差异，建立了一种鉴定疫苗毒株和野毒株的RT-PCR检测方法，在缺失序列的两端设计一对引物，致弱毒株扩增出194bp的片段，野生株扩增出245bp片段，本方法可以区分疫苗毒株和野毒株(ParkSetal2008)。许多研究推测ORF3基因与病毒的传染性和致病性相关，但是其功能目前仍未知。用ORF3的四个跨膜区蛋白构建一个四聚体结构模型，在感染PED病毒的细胞中可以检测到ORF3蛋白，其功能主要作为离子通道，特别是作为钾离子通道。当ORF3基因的siRNA被沉默之后，病毒感染Vero细胞后的产量减少。PEDV弱毒株的ORF3基因编码一个缺失49个氨基酸的截断蛋白，该蛋白缺失离子通道活性。(KaiW.etal,2012)。1.3PED疫苗的研究进展1.3.1灭活疫苗灭活疫苗在PED疫苗研究中出现最早，目前主要有细胞灭活苗和组织灭活苗。1993年，王明等报道了用甲醛灭活加氢氧化铝佐剂制成的组织灭活苗。经后海穴注射仔猪的主动免疫率和被动免疫率可达85%和97%，免疫期可达6个月。但是成本较高，疫苗的批间质量难以控制（王明等，1993）。1994年，马恩奇等在细胞培养液中加入胰酶，成功将CV777毒株适应Vero细胞，将传至28代细胞毒经灭活制成氢氧化铝细胞灭活苗，对仔猪的主动免疫率为88.9%，被动免疫率为90.7%。该疫苗安全性好，易于制备，广泛应用于猪流行性腹泻的防治（马恩奇等，1994）。1.3.2活疫苗1998年，佟有恩等用传统强毒株CV777在vero细胞上传代147代致弱，又对弱毒株进行克隆纯化，得到毒株毒力减弱，并可稳定传代，免疫原性良好。免疫试验证实主动免疫为95.9%，被动免疫保护率为96.2%。稳定性试验证明，毒株经6次返祖传代仍然稳定，未见毒力返强，证明此弱毒株已符合弱毒疫苗毒株的条件（佟有恩等，1998）。临床分离的猪流行性腹泻KPEDV-9减毒毒株是在vero细胞上连续传代93代后得到。对仔猪的致病性和母猪的免疫原性及安全性检验发现，减8万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用毒毒株对新生仔猪的致病性降低。口服减毒KPEDV-9毒株的妊娠母猪抗体水平升高。仔猪口服减毒KPEDV-9之后能够抵抗PEDV野毒株的攻毒。妊娠母猪攻毒后每窝产子数能够达到平均水平。以上结果表明通过连续传代得到的KPEDV-9毒株能够用于疫苗的生产来增加仔猪对PEDV的抵抗力（KweonCHetal,1999）。2007年，韩国学者SongDS等研制出一种新DR13弱毒口服疫苗，该疫苗毒株是将DR13强毒在vero细胞上连续传100代致弱后得到的。临床试验证明该疫苗对仔猪具有很高的保护率，并且在猪体内经过三代的返祖传代，毒力没有返强。通过对比试验发现口服弱毒疫苗组仔猪的死亡率较肌注的要低，抗体水平比肌注组高(SongDSetal,2007)。1.3.3基因工程疫苗目前基因工程疫苗研究比较多的是以工程菌为载体的疫苗，常见的工程菌有乳酸菌，减毒沙门氏菌等。乳酸菌是人和动物肠道内的常在菌，在食品领域长期应用是公认安全的微生物。使用乳酸菌作为载体有很多的优点，因其本身具有佐剂的作用。不会对机体产生有害的免疫学反应，可以对动物机体多次免疫而不会造成伤害。乳酸菌本身分泌的乳酸菌素等有机产物具有抗菌作用，对病毒性腹泻的防治有辅助的作用。将乳酸杆菌应用到基因工程疫苗中有广阔的前景。葛俊伟等将PEDV的N基因片段插入到乳酸杆菌载体中成功构建了表达猪流行性腹泻N基因片段的重组干酪乳酸杆菌表达载体。以乳酸菌载体系统作为口服疫苗免疫动物发现，机体产生了循环抗体IgG和黏膜抗体IgA，并且21d时试验组的抗体水平明显高于对照组。免疫组淋巴细胞增殖指数和细胞因子产生数均明显高于对照组，证明重组干酪乳酸杆菌可以刺激机体产生细胞免疫（葛俊伟等，2009）。董丽娜等从PEDV中扩增出COE基因成功构建了乳酸乳球菌表达载体pNZ8149，并成功表达。经过进一步的验证，该表达载体为分泌性表达载体，为进一步的动物免疫试验奠定了基础。向敏等人构建了PIRES2-EGFP-COE真核表达载体，并在Vero细胞中成功表达目的蛋白。将重组质粒免疫小鼠能够刺激产生相应的血清抗体，为猪腹泻病毒的核酸疫苗的研究奠定了基础（向敏等，2013）。本实验室徐丽丽将从PEDV阳性病料中扩增得到的PEDVS1D和COE基因克隆到表达质粒pYA3493中，构建pYA-SD和pYA-COE质粒，并将质粒转化至减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500缺失菌，成功构建减毒猪霍乱沙门氏菌C501-SD和C501-COE菌株。重组菌二联冻干疫苗的临床免疫试验显示，91日龄健康仔猪口服1×10CFU量的重组菌，连续观察7天，仔猪体温正常，吮乳正常，无不良反应发生。PED发病猪场重组菌二联冻干疫苗免疫试验发现，A场免疫组仔猪腹泻率由100%降至18%~30%，B场仔猪死亡率由80%降至8%~20%。表明构建的重组菌二联冻干疫苗具有良好的免疫效果（徐丽丽，2011）。9万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文1.4黏膜免疫黏膜免疫应答主要以sIgA为主，sIgA通过分泌到动物的黏膜表面而发挥作用。动物初乳中含有针对肠道微生物和食物抗原的特异性IgA抗体。sIgA具有黏膜亲和性以及蛋白酶抵抗特性，有助于抗体在肠道内的存在并完成溶菌及中和病毒的作用（姜厚涛等，2013）。由于黏膜表明广阔的表面积，机体的黏膜表面是主要的病原侵入潜位点。黏膜表面分泌物中包含了大量的免疫球蛋白，在黏膜表面免疫免疫保护作用中发挥了重要的作用。IgA抗体是众多外分泌抗体中最重要的抗体，在抵抗突破黏膜屏障的外源细菌和病毒过程中发挥了重要作用（WoofJM,2005）。猪流行性腹泻病毒具有特殊的肠嗜性，普通的疫苗只能刺激机体产生全身性循环抗体，对肠道部位的保护力效果较差，因此仔猪肠道的黏膜免疫反应对PED的防控意义重大。母猪黏膜免疫分泌的乳汁IgA抗体水平更能体现猪流行性腹泻疫苗对仔猪的临床保护力。但是目前国内没有相关IgA抗体水平的检测标准（许宝华等，2012）。仔猪经人工口服感染PEDV后，可观察到肠黏膜派尔氏结内的T淋巴细胞和B淋巴细胞出现明显的增殖活化现象。同时发现肠道黏膜淋巴结的局部免疫反应在先，脾脏在稍后的时间出现T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，出现全身免疫反应，并且前者的淋巴细胞百分率要高于脾脏，提示经口免疫的引起的肠道局部免疫对本病的意义要大于全身免疫(张远钰等，1989)。刘伟杰等通过试验发现，仔猪感染后首先引起局部的肠道黏膜免疫，然后激发全身免疫反应。试验猪经口感染PEDV后15d后肠黏膜的IgA产生细胞数达到高峰，小肠后端及盲肠消化液中的IgA含量也达到最高水平，接毒后35d恢复正常水平；而血液中的IgG抗体水平达到高峰需要8周左右，22周恢复正常水平，局部黏膜免疫的反应的周期比全身免疫反应周期短（刘伟杰等，1989）。1周龄以内仔猪的免疫系统发育尚未完全成熟，感染病毒之后免疫系统出现损伤表现为淋巴滤泡浓缩，碎裂，肠黏膜集合淋巴结可见淋巴细胞增殖反应，肠道黏膜固有层出现大量的淋巴细胞核浆细胞。一月龄以上的猪只攻毒后可见明显的局部黏膜反应，一般认为空肠的中、后段，回肠以及回盲口黏膜上皮细胞的淋巴细胞及固有层巨噬细胞可以捕获PED病毒颗粒，提呈给T淋巴细胞和B淋巴细胞，激活肠道黏膜上皮IgA、IgM抗体产生细胞的增殖活化，产生的IgA和IgM分泌到肠道消化液，引起黏膜免疫应答。1.5诊断方法的研究概况1.5.1病毒的分离鉴定取疑似PEDV感染仔猪小肠后端肠道组织，或刮取肠道黏膜，无菌处理后接种10万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用长满单层的vero细胞，放于37℃，5%CO2细胞培养箱内盲传数代，观察细胞病变。当细胞出现拉网，颗粒化，融合，脱落等情况后收取病毒液，放于-20℃冻融3次之后，将收集的病毒液灌服仔猪，如果仔猪出现腹泻症状，证明该病毒为腹泻毒株。庄金秋等取病死仔猪的十二指肠，空肠及内容物制成匀浆，接种vero细胞盲传10代后出现局部CPE，20代后出现典型的CPE。用RT-PCR方法检测20代vero细胞培养物，证明分离病毒为PEDV毒株（庄金秋等，2013）1.5.2免疫电镜法使用普通的电子显微镜可以观察到病毒外表面呈冠状的PEDV病毒离子，但是其它冠状病毒，如猪传染性胃肠炎也能观察到病毒离子外部的放射冠，不能加以区分。免疫电镜法是以免疫学原理为基础，带有特殊标记的抗体与相应的抗原发生特异性结合，根据标记物指示抗原所在部位。该方法可以鉴定并加以区分猪流行性腹泻病毒。王继科等建立了PEDV和TGEV的免疫电镜鉴别方法，该方法优点是具有快速、简单、直观等特点。但是该方法的仪器比较贵，所以临床检测应用并不广泛（王继科等，1991）。1.5.3血清中和试验动物机体感染病毒之后，体内产生可以中和病毒的特异性抗体，从而阻止病毒对组织细胞的吸附和侵入，使病毒失去感染或致病能力。病毒被中和抗体中和之后，通过比较病毒残存的感染力来确定免疫血清中和病毒的能力。中和试验主要有固定血清稀释病毒法和固定病毒稀释血清法，目前应用较多的是后者。林志雄等应用临床分离的PEDV-G1毒株建立了固定病毒稀释血清的中和试验方法。使用该方法检测5个猪场的152份血清，结果发现没有发生过PED的猪场血清为阴性反应，发生过PED或注射过PED油乳灭活苗的猪场PED抗体为阳性。证明该方法具有较高的敏感性。PEDV不能被TGEV，HCV，PRV，ARV阳性血清中和，证明该方法特异性较高(林志雄等，1994)。1.5.4免疫荧光方法免疫荧光方法是将荧光标记技术与免疫学方法相结合，主要用于研究特异性的抗原在体内外的分布情况。荧光素与抗体结合之后与待检抗原反应，如果抗体与抗原发生特异性反应后，使用荧光显微镜检测荧光素的荧光来对抗原进行定位。目前常见的方法有直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、免疫过氧化物酶技术等。崔现兰等用用直接免疫荧光技术检测人工感染仔猪PEDV阳性率为91.4%（42/46），自然11万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文腹泻猪仔猪PEDV阳性率为47.8%（11/23）。应用间接免疫荧光检测PED阳性猪场的血清阳性率为89%（89/100）；屠宰场采集的血清，抗体阳性率为25.2%（51/202）。将PED阳性血清1:1024稀释仍能坚持检出阳性。1.5.5酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）自1971年首次报道之后，由于该方法具有快速、简便、经济实用、灵敏性高、特异性好等优点，目前广泛应用于兽医临床的抗原和抗体检测。于强等以猪流行性腹泻病毒感染猪胎肠单层细胞培养物，将抗原反复冻融处理，建立了PED间接ELSIA抗体检测方。该方法针对TGEV血清、RV血清及猪梭菌性肠炎血清等16份样品检测均为阴性，证明该方法检测PEDV抗体与其它3种病毒血清无交叉反应。89头疫区猪血清抗体检测阳性率为75％(67/89)，82头份屠宰场猪血清抗体阳性率为53％（于强等，1987）。朱维正等应用PEDV双抗体夹心ELISA法检测120头健康猪和5头TGE感染病猪粪便样品，均未出现交叉反应，检测15头PEDV感染仔猪粪便样品，全部阳性；将PEDV阳性和阴性各3份粪便样品的ELISA检测结果与电镜方法比较，两种方法阳性符合率97.37％，阴性符合率100％。对不同地区采集的112份腹泻样品进行PEDV检测，阳性率为60.71％（朱维正等，1988）。孙智锋等应用纯化的PEDV和酶标葡萄球菌A蛋白(PPA)建立了PPA-ELISA，免疫猪血清PEDV抗体的动态检测和自然感染猪血清抗体的检测表明，该方法具有敏感性高、特异强、简便、快速等优点，适用于猪场血清样品PEDV抗体水平的批量检测（孙智锋等，1995）。陈茹等使用聚乙二醇沉淀法纯化PEDV抗原，建立了PEDV抗体Dot-ELISA检测方法。该法敏感性、特异性、重复性好，且方便快捷，适用于样品的批量检测。应用该方法检测来自加拿大、台湾、海南和广东等地的834份种猪血清样品，PEDV抗体阳性率为21%（陈茹等，1997）。韩蓉等以纯化的PEDV为包被抗原建立了PEDV抗体间接ELISA检测方法。使用该方法检测PRRSV、PCV2、HCV、PRV和FMDV血清抗体均为阴性，批间和批内重复试验变异系数为2.5%～8.3%。来自江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品的抗体阳性检出率为56.76%（韩蓉等，2013）。1.5.6聚合酶链式反应目前聚合酶链式已经广泛应用于病毒的分子检测技术中，与传统的检测方法相比，本方法具有特异性强、灵敏性高、省时方便和适用于群体检测等优点。罗永珍根据猪流行性腹泻病毒N基因高度保守的区域序列，设计合成一对引物，建立了针对PEDVN基因的RT-PCR检测方法，具有较高的敏感性和特异性（罗永珍，2012）。12万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用邓祖丽颖等，根据猪流行性腹泻病毒的M基因设计内外两对引物，建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。使用该方法可以检测出50fg猪流行性腹泻病毒的RNA模板。使用该方法针对TGEV、ARV、PRRSV、HCV检测均为阴性。使用单一引物的RT-PCR方法和巢式RT-PCR方法对79份腹泻临床样品进行对比试验，结果显示前者检出PEDV阳性率为62.3%，后者检出PEDV阳性率为68.35%，证明巢式RT-PCR方法比普通RT-PCR方法更加灵敏（邓祖丽颖等，2014）刘邓等根据PEDVN基因序列分别设计合成了一对探针和引物。将克隆获得的N基因质粒作为阳性标准品，建立810了一种PEDVTaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法在10～10拷贝/μL范围内均表现出良好的线性关系，可检测出10拷贝/μL的质粒DNA模板；选择PCV2、JEV、HCV、PEESV、PRV和PPV为检测模板时，均未出现荧光信号；重复性试验检测发现其该方法异系数均小于2%。60份临床腹泻病料的对比检测试验发现，该方法PEDV阳性检出率为92%，而常规RT-PCR检测方法阳性检出率为80%。表明荧光定量RT-PCR方法较常规PCR检测方法敏感性高（刘邓等，2010）。RenXF等首次报道了PEDV逆转录-环介导等温核酸扩增技术（RT-LAMP），试验证实该方法比传统的RT-PCR方法敏感约一万倍，并且该方法可以在普通的水浴或加热条件下进行(RenXFetal,2011)。1.6研究目的与意义猪流行性腹泻病在世界范围内广泛流行，特别是亚洲地区，造成了大量的哺乳仔猪死亡，耐过猪饲料报酬降低，生产成本增加，妊娠母猪腹泻痊愈后有造成流产的迹象。2010年以来，我国各地冬季相继爆发了PED，哺乳仔猪的死亡率高达30%~100%，波及到数十个省份，造成上百万头哺乳仔猪的死亡，给我国的养猪业带来了严重的经济损失。目前，猪流行性腹泻血清IgG抗体检测方法主要有微量血清中和试验法、间接免疫荧光法(IFA)和全病毒包被的ELISA法等。这些检测方法多以全病毒制备的抗原作为基础，存在潜在排毒的风险。大量研究结果表明，免疫母猪主要通过初乳将母源IgA抗体传递给哺乳仔猪，使其获得猪流行性腹泻的被动免疫保护，乳汁分泌型IgA抗体的黏膜免疫是仔猪获得PEDV免疫保护的最佳途径。目前PED抗体检测方法中主要以血清IgG抗体检测为主，国内未见母猪乳汁IgA检测方法的相关报道。因此本研究旨在建立一种安全、稳定、快速且特异性和重复性高的猪流行性腹泻IgA、IgG抗体ELISA检测方法，从而能够用于PED临床乳汁和血清样品的抗体检测。同时，该方法的建立在PED疫苗IgA、IgG抗体评估方面具有重要的理论和实践意义。13万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文2.猪流行性腹泻S1D蛋白的表达、纯化与活性鉴定2.1材料2.1.1质粒和菌株重组质粒pET-32a-S1D，大肠杆菌DH5α由本实验室构建并保存，大肠杆菌BL21(DE3)购于大连宝生物公司。2.1.2试验器材PCR仪(S1000TMThermalCycter)，美国BIO-RAD公司生产；紫外凝胶成像仪(MolecularImageStation2000MM)，德国KODAK公司生产；BIO-RAD垂直电泳板；HZQ-F160全温振荡培养箱，由太仓市实验设备厂生产；低温高速离心机，由德国Eppendoff公司生产制造；超声波破碎仪，由美国UltrasonieProeessor公司生产；AvantiTMJ-20型高速低温离心机，由美国Beckman公司生产；显微镜，由OLYMPUS公司生产制造。2.1.3主要培养基及缓冲液的配制2.1.3.1培养基LB液体培养基：1%蛋白胨(10g)、0.5%酵母提取物(5g)、1%NaCl(5g)、用10mol/L的NaOH调至pH值7.0-7.2，15磅高压灭菌20min。TSB培养基：3%TSB粉末(30g)溶于ddH2O中，15磅高压灭菌15min；TSA培养基：4%TSA粉末(40g)溶于ddH2O中，15磅高压灭菌15min；2.1.3.2SDS-PAGE相关缓冲液5×Tris-GlyeineBuffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)：Trisbase15.1g，甘氨酸94g，SDS5g，加ddH2O搅拌溶解，然后用ddH2O定容至1000mL；30%(w/v)聚丙烯酰胺母液(Acrylamide)：称取290g丙烯酰胺和10gN，N-亚甲双丙烯酰胺(BIS)溶于ddH2O中，定容至1L后，用0.45µm滤膜过滤，于4℃避光保存备用；10%(w/v)过硫酸铵(APS)：称取1g过硫酸铵，加入10mL去离子水溶解，于4℃保存备用；14万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用5×SDS-PAGELoadingBuffer：1molpH6.8Tris-HCl，0.5gSDS，25mg嗅酚蓝，100%甘油2.5mL，ddH2O定容至5mL，500µL/份分装室温保存，用前每份加25µLβ-琉基乙醇；考马斯亮蓝染色液(1L)：0.1%考马斯亮蓝R-250(1g)，25%异丙醇(250mL)，10%冰醋酸(100mL)，650mLddH2O，搅拌均匀后滤纸滤去颗粒物质，室温保存；考马斯亮蓝染色脱色液(1L)：10%冰醋酸(100mL)，45%乙醇(450mL)，450mLddH2O，混合均匀室温保存。2.1.3.3Westernblot相关溶液电转缓冲液(1L)：39mmol/L甘氨酸(2.9g)，48mmol/LTris-base(5.8g)，0.037%SDS(0.37g)，20%甲醇(200mL)，溶于800mLddH2O，用ddH2O定容至1L；TBS缓冲液(pH8.0)：10mmol/LTris-base(1.21g)，150mmol/LNaCl(8.8g)，溶于800mLddH2O中，用盐酸调至pH8.0后定容至1L；TBST缓冲液：TBS缓冲液中加入终浓度为0.05%(V/V)的Tween-20；封闭液：在TBST缓冲液中加入1.0%(W/V)的牛血清蛋白(BSA)2.1.3.4原核表达相关溶液不可溶性表达产物提取液A(BufferA)(1L)：50mmolTris-base(6.057g)，0.5mmolEDTA(0.1861g)，50mmolNaCl(2.922g)，5%的甘油(50mL)，DTT0.5mmol(用时加)。IPTG(10mg/mL)：称取1gIPTG溶于100mLddH2O中，0.22µm滤膜过滤除菌后，于-20℃保存备用；50×TAE(pH8.5)：称取242gTris-base，37.2gNa2EDTA，溶于800mLddH2O中，加入57.1mL冰醋酸后，再用ddH2O定容至1L；2.2试验方法2.2.1目的蛋白在大肠杆菌中表达(1)将10µL重组质粒pET-32a-S1D加入到100µLE.coliBL21细胞中混匀，冰浴30min。(2)42℃热激90S后，迅速置冰上，冰上静置5min。(3)加入500µLLB液体培养基混匀，37℃，200r/min，培养45~60min。(4)4℃，500r/min，离心5min，弃掉500µL液体，用剩余的100µL液体重悬沉淀，然后涂布于准备好的Amp/LB固体培养基上，37℃，倒置培养12~16h。(5)挑取单菌落接种于5mLAmp/LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。按15万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文1:100接种于l00mL的Amp/LB液体培养基中，于30℃，180r/min摇床中培养至菌液OD600nm值为0.6~0.8。(6)加入IPTG至终浓度为0.8~1µg/mL，37℃，180r/min；以同样的方法诱导含空质粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)7h的菌液作对照，SDS-PAGE电泳观察表达结果。2.2.2SDS-PAGE分析样品制备:将IPTG诱导过的菌液，4℃，12000r/min，离心1min收集菌体沉淀用80µL灭菌去离子水重悬菌体，再加入1/4体积的5×SDS-PAGELoadingBuffer(含β-琉基乙醇)，充分混匀后，沸水煮沸10min，然后迅速置于冰上，5min后，12000r/min，离心3min。聚丙烯酰胺凝胶的制备:表2-112%聚丙烯酰胺凝胶的成分Table2-1Thecomponentsof12%SDS-PAGE组分用量（mL）ddH2O3.330%Aerylamide4.01.5mol/LpH8.8Tris-HCl2.510%SDS0.110%过硫酸铵0.1TEMED0.004总量10.0各组分加入后迅速吹打混匀，沿玻璃板灌制凝胶(约加入7mL)，注意不要有气泡产生，上层加约1.5mL去离子水，室温凝胶30min。表2-25%聚丙烯酞胺凝胶的成分Table2-2Thecomponentsof5%SDS-PAGE组分用量（mL）ddH2O2.130%Aerylamide0.51.5mol/LpH8.8Tris-HCl0.3810%SDS0.0310%过硫酸铵0.03TEMED0.003总量3.0将上述各成分轻轻吹打混匀，弃去分离胶上面的去离子水，滤纸吸干，灌入凝胶，迅速插入制胶梳子，室温凝胶30min。(1)上样:按BIO-RAD使用说明组装垂直电泳槽，向电泳槽内注入电极缓冲液，每孔加20µL处理样品上清；(2)电泳:先调制80V恒压电泳，待样品进入分离胶层后，调整电压至120V继续电16万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用泳，直至溴酚蓝移行到底部时停止。(3)染色:加入考马斯亮蓝R250染色液，至没过凝胶，置于水平摇床上室温染色2~3h。(4)脱色:将凝胶浸泡于脱色液中，置于水平摇床上脱色，其间每1~2h更换一次脱色液，直至背景清晰为止。2.2.3Westernblot分析(1)电泳:样品制备好以后，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取出凝胶。(2)电转:切六张3mm宽的滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC)，滤纸和硝酸纤维素膜要与聚丙烯酰胺凝胶的大小相同；将滤纸和NC膜放于电转缓冲液中浸泡5min；安装电转装置:平放底部电极(负极)，然后依次按3张滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜和另外3张滤纸。每一层都需精确对齐，并用玻璃棒用赶出气泡；盖上阳极板，接通电源，电流大小按凝胶面积0.65mA~1.0mA/cm2，电转1.5~2h。(3)封闭:转膜结束后，断开电源，将NC膜放于TBST中漂洗一次，然后浸泡于封闭液中(含1%BSA的TBST)，37℃，平缓摇动1~2h或4℃封闭过夜，然后用TBST洗涤3次，5min/次；(4)靶蛋白与一抗的结合：将NC膜放入经TBST稀释的一抗中(血清1:100)，37℃温育1h或室温反应1.5h，然后将NC膜用TBST洗3次，5min/次；(5)靶蛋白与二抗结合:将NC膜放入用TBST稀释过的二抗中(一般为1:2500~1:5000稀释)，室温温育0.5~1h，然后将NC膜用TBST洗4~6遍，每次5~10min，再用TBS洗2次，以彻底除去Tween-20，每次5min。(6)显色:将NC膜放入10mL底物液中避光显色，蛋白显现后，用ddH2O终止反应，然后采集图片。2.2.4原核表达产物的提取经SDS-PAGE电泳初步鉴定，该蛋白主要以包涵体的方式在大肠杆菌中得到表达，因而主要采用针对不溶性表达产物的蛋白提取方法，其方法步骤如下:(1)将2.2.1中的饱和菌液按1:100接种于200mLAmp/LB液体培养中，于37℃，200r/min培养3h至OD600nm值约为0.8时，加入IPTG至终浓度0.8~1mmol/L，28℃，200r/min，继续诱导培养6h；(2)将诱导后的菌液，4℃，8000r/min，离心10min，收集菌体沉淀，沉淀用20mLBindingbuffer重悬，反复冻融3~5次后，置冰上，经压力破碎至清亮，4℃，12000r/min，离心20min，弃上清；(3)沉淀用19.7mL的BufferA重悬，然后加入0.3mL20%的N-月桂酞氨肌钠盐(SKL)17万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文贮存液，涡旋仪上剧烈震动溶解，室温静置30min~2h；(4)4℃，12000r/min离心10min，弃沉淀；(5)向上清液中加入20%的pEG4000210µL，然后依次加入50mmol/L的氧化型谷胱甘肽420µL和100mmol/L的还原型谷胱甘肽420µL，4℃，静置30min~2h。(6)以PBS透析3天，SDS-PAGE鉴定后，分装，-80℃保存备用。2.3试验结果2.3.1S1D蛋白的SDS-PAGE结果pET-32a-S1D重组质粒在E.coliBL21中稳定表达，经SDS-PAGE分析，如图2-1所示，S1D蛋白主要在包涵体沉淀中表达，上清可溶性蛋白的表达量较低或不表达。图2-1S1D蛋白的SDS-PAGEFig.2-1IdentificationofS1DproteinbySDS-PAGEM:proteinmolecularweightmarker；1:thepurifiedproductofS1Dsupernatantprotein；2:thepurifiedproductofS1Dinclusionbodyprotein.2.3.2S1D蛋白的Westernblot分析将纯化的S1D蛋白经Westernblot分析，如图2-2所示，处于第1泳道的S1D蛋白表达量少，位于第2泳道的S1D蛋白在沉淀中表达量大，且反应原性良好。18万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用图2-2S1D蛋白的westernblot检验Fig.2-2IdentificationofS1DproteinbyWesternblot1:thepurifiedproductofS1Dsupernatantprotein；2:thepurifiedproductofS1Dinclusionbodyprotein.2.3.3蛋白浓度的测定使用Bradford法测定蛋白质浓度，建立蛋白浓度测定标准曲线，如图2-3所示。S1D蛋白5次重复测定OD630nm平均值为1.354，所以S1D蛋白浓度为819µg/mL。图2-3蛋白浓度测定标准曲线Fig.2-3Thestandardcurveofproteinconcentration2.4小结与讨论重组菌在37℃摇床培养3h后，于28℃加入IPTG诱导6h集菌，压力破碎后纯化蛋白。SDS-PAGE试验结果显示S1D蛋白上清可溶性蛋白无表达或表达量较低，包涵体蛋白浓度高；WesternBlot结果显示S1D蛋白沉淀表达量大，且具有良好的免疫原性。S1D上清可溶性蛋白的含量较少。以上试验结果表明本试验表达的猪流行性腹泻病毒S1D蛋白在沉淀中大量表达，反应原性良好，可以作为后续ELISA试验的备选抗原。19万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文3.猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立3.1材料3.1.1主要试剂和仪器辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgA购于AbDSerotec公司；TMB底物显色液购于武汉科前动物生物制品有限公司；96孔酶标板为corning公司产品；Theromo-MK3型酶标仪购自赛默飞世尔（上海）有限公司；免疫母猪PED阳性乳汁样品和阴性样品为本实验室保存；其他化学试剂为分析纯。3.1.2ELISA相关试剂的配制包被液:25mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)；Na2CO3(1.59g)，NaHCO3(2.93g)，ddH20加至1000mL。洗涤液:含0.05%Tween-20的PBST(pH7.2~7.4)。NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，Na2HPO4.12H2O(2.9g)，KH2PO4(0.2g)，Tween-20(0.5ml)，ddH2O加至1000mL。封闭液:0.5gBSA溶于100mL洗涤液。稀释液:0.1gBSA溶于100mL洗涤液。3.2试验方法3.2.1待检材料的预处理采集新鲜母猪乳汁，于4℃，10000r/min离心5min，弃去上层乳脂层，用灭菌枪头小心吸取中间层的乳清(whey)，注意不要将底部的乳汁沉淀部分吸出。乳清部分可以直接稀释用于抗体检测。待检样品长期放置需-80℃分装保存。3.2.2免疫荧光试验检测乳汁中的IgA抗体2将vero细胞在75m细胞瓶中培养，待长满单层后，使用15mLMEM生长液（含10%的四季青新生牛血清，5μg/mL胰酶）轻轻吹打，将吹散的细胞悬液加入MEM20万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用生长液80mL，200μL/孔，加入96孔细胞板中，在37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞长成单层后，每孔接入200TCID50PEDV病毒液，100μL/孔，再加入MEM细胞维持液100μL/孔，同时设两列不接毒的空白对照组。每隔6h观察细胞病变情况。待细胞刚出现病变时，弃去96孔细胞培养板中的MEM维持液。用PBS液洗涤，200μL/孔，摇床摇动5min，甩干，重复3次。加入-20℃取出的冷乙醇，100μL/孔，然后放入-20℃冰箱，固定30min。洗涤同上，将96孔板自然晾干。分别将免疫母猪乳清及未免疫母猪乳清做1:10倍稀释，100μL/孔，加入96孔板，各做2孔重复；在37℃恒温箱孵育30min。用PBS溶液洗涤，200μL/孔，摇床摇动5min，甩干，重复3次。加入1:60倍稀释的FITC兔抗猪IgA荧光二抗，在37℃温箱孵育30min。洗涤同上；荧光显微镜下观察记录结果。3.2.3抗原最佳包被浓度和乳汁稀释度的选择采用棋盘滴定法，以磷酸盐缓冲液为稀释液将纯化的S1D蛋白稀释至终浓度为8µg/mL，4µg/mL，2µg/mL，1µg/mL，0.5g/mL，每个浓度包被两列，每孔包被100µL，4℃包被过夜。PBST洗涤液洗涤5次，每次3min，洗涤后拍干，PBST洗涤液为含0.05%Tween-20的0.01mol/L的PBS，pH7.4。加入含0.5%（w/v）牛血清白蛋白的PBST，200µL/孔，37℃封闭2h，洗涤同上。洗涤后拍干备用。将阴、阳性乳汁分别按1:10，1:20，……，1:640，1:1280梯度稀释后加入包被板，100µL/孔，37℃作用1h，取出后洗涤同上。拍干后加入1:10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgA酶标二抗，100µL/孔，37℃反应30min，洗涤同上。洗涤后加入TMB底物液，100µL/孔，37℃避光反应10min。加入2mol/L硫酸50µL/孔，终止反应，酶标仪630nm波长读数。以阳性血清OD值接近1，P/N值最大孔对应的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原包被浓度和乳汁稀释度。3.2.4抗原最佳包被时间的选择以最适抗原包被浓度4种不同条件包被酶标板:4℃过夜；37℃孵育30min，4℃过夜；37℃孵育60min，4℃过夜；37℃孵育90min，4℃过夜。包被完成后，其他步骤同3.2.3。比较各组阴、阳性乳汁P/N值，以选择最佳包被时间。3.2.5最佳封闭液的选择以3.2.3确定的抗原最佳包被浓度包被酶标板，封闭液分3组，分别为1µg/mL21万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文BSA，10µg/mL脱脂奶粉（(SMP，skimmedmilkpowder），1µg/mL明胶（Gelatin），每组封闭液用PBST倍比稀释为3个稀释度。每孔加入200µL封闭液，37℃封闭1h。封闭完成后，乳汁按照最佳稀释度加入，其他步骤同3.2.3。比较各组阴、阳性乳汁的P/N值以选择最佳封闭液。3.2.6最佳封闭时间的选择以最适抗原浓度包被酶标板，用3.2.3中已确定的最佳封闭液封闭酶标板，封闭时间分成4组，分别为37℃孵育30min，60min，90min，120min，封闭完成后，乳汁按照确定的最佳稀释度加入，其他步骤同3.2.3。比较各组阴、阳性乳汁P/N值，以选择合适的封闭时间。3.2.7最佳一抗作用时间的选择按照优化的条件进行包被、封闭后，乳汁按照确定的最佳稀释度加入，37℃分别作用30min，60min，90min，120min，其他步骤同3.2.3。比较各组阴、阳性乳汁P/N值，以选择合适的乳汁孵育时间。3.2.8最佳酶标抗体作用时间的选择将酶标抗体按照推荐的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用30min，45min，60min，其他步骤同3.2.3，比较各组阴、阳性乳汁的P/N值，以选择合适的酶标抗体作用时间。3.2.9阴阳性临界值的确定取50份间接免疫荧光（IFA）鉴定的阴性乳汁，在优化条件下检测乳汁OD630nm值，计算样品OD630nm值的平均值(X)和标准差(SD)，根据统计学原理，样本的OD630nm值≥平均值(X)+3SD时，判为阳性，OD630nm值≤平均值(X)+2SD时，判为阴性，介于二者之间者判为可疑。3.2.10重复试验3.2.10.1批内重复试验将同一批次纯化的蛋白包被ELISA板，取5组不同抗体水平的阳性乳汁样品和1组标准阴性样品，每组样品分为6份，于-20℃分装冻存，在6个不同时间点分别进行ELISA检测，统计检测结果并计算平均值、标准差和变异系数。22万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用3.2.10.2批间重复试验用不同批次制备的4批蛋白抗原分别包被ELISA板，取5组不同抗体水平的阳性样品和1组标准阴性样品进行ELISA检测，统计检测结果并计算标准差、平均数值和变异系数。3.2.11敏感性试验选取六头实验母猪，产前30d免疫某疫苗生产厂家生产的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗。母猪分娩后采集乳汁，采集的时间点分别为产后0d、3d、7d、14d、21d。将采集的乳汁用同一批包被的IgA检测抗原板检测。取5份阳性样品做1:30，1:60，1:120，1:240，1:480，1:960共6个梯度稀释，检测结果进行敏感性分析。3.2.12比较试验对临床采集的453份PEDV阳性猪场的母猪乳汁样品使用本试验建立的IgA抗体检测方法检测，并与韩国BIONOTE公司生产的IgA抗体检测试剂盒进行对比，计算本方法的阳性预测值和阴性预测值以及灵敏度，特异度和总符合率。阳性预测值为本方法诊断为阳性的个体中发生腹泻的概率。阴性预测值即本方法诊断为阴性的个体中不发生腹泻的概率。3.2.13母猪乳汁IgA抗体水平与仔猪腹泻关系的评估河北某猪场仔猪发生腹泻，病原检测确诊为猪流行性腹泻病毒。随机选取产房中同一批次待产母猪，跟踪采集母猪乳汁，采集的时间点分别为产后0d、3d、7d、14d、21d。选取发生腹泻和未发生腹泻的仔猪各3窝，检测乳汁中的猪流行性腹泻IgA抗体，以期评估本次仔猪腹泻与母猪乳汁IgA抗体水平的关系。3.3.14疫苗免疫后IgA抗体对比试验选取10头母猪，分为两组，每组5头，第一组产前30d和产前14天免疫本实验室构建的猪流行性腹泻减毒沙门氏菌基因工程口服疫苗，第二组于产前30d普免市售T-P二联灭活疫苗。分别采集10头母猪的初乳，检测初乳中的PEDV-IgA抗体。对比两种疫苗的抗体水平。23万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文3.3结果与分析3.3.1免疫荧光试验检测乳汁中的IgA抗体母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体IFA检测结果如下图3-1所示，免疫母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体IFA反应阳性，如图3-1-A所示；未免疫母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体IFA反应阴性，如图3-1-B所示。图3-1母猪乳汁PEDV-IgA抗体IFA实验A：免疫母猪乳汁；A1：A孔细胞自然光对照B:未免疫母猪乳汁；B1：B孔细胞自然光对照Fig.3-1IFAtestofPEDV-IgAantibodyinsowmilkA:Milkofvaccinatedsows；A1：ControlcellsofAholeinnaturallightB:Milkofun-vaccinatedsows；B1:ControlcellsinBholeinnaturallight3.3.2抗原最佳包被浓度和乳汁稀释度棋盘滴定结果如表3-1所示，当抗原包被浓度为1µg/mL，乳汁稀释倍数为1:10时，阳性乳汁OD630nm值接近1，且此稀释度的P/N值最大。因此选择最佳抗原包被浓度为1µg/mL，最佳乳汁稀释倍数为1:10。24万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用表3-1棋盘滴定结果Table3-1TheOD630nmofcheckerboardtitrationMilkOD630nmofantigendilutiondifferentlySampledilution8µg/mL4µg/mL2µg/mL1µg/mL0.5µg/mL1:102.1421.8711.6431.1260.6581:201.7851.4331.0960.6960.456PositiveWhey1:401.4051.0100.7330.4610.280阳性乳清1:801.0490.7560.4960.3310.2341:1600.7110.5220.3300.2340.1571:100.5410.4180.2540.1710.1051:200.4420.3000.2140.1280.106NegativeWhey1:400.3020.2270.1400.0950.103阴性乳清1:800.2460.1680.1120.0900.0911:1600.1670.1230.0940.0680.0833.3.3最佳抗原包被条件用最佳包被浓度包被抗原，37℃包被不同时间后，4℃过夜处理。发现37℃孵育60min，4℃过夜时P/N最大，如表3-2所示；确定37℃孵育60min，4℃过夜为抗原包被的最佳条件。表3-2抗原最佳包被时间的选择Table3-2Resultsoftheoptimaltimeforcoatingofrecombinantprotein4℃37℃，30min，37℃，60min，37℃，90min，Sampleovernight4℃，overnight4℃，overnight4℃，overnightPositiveWhey0.8400.9861.1421.557阳性乳清NegativeWhey0.0830.0940.1080.124阴性乳清p/N10.12010.52710.57412.5563.3.4最佳封闭液用不同封闭液对包被的酶标板进行封闭，结果如表3-3所示，5%的脱脂奶粉作为封闭液时P/N值最大。确定最佳封闭液为5%（W/V）的脱脂奶粉。25万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文表3-3最佳封闭液的选择Table3-3Resultsoftheoptimalblockingsolution1%0.50%0.25%10%5%2.50%1%0.50%0.25%SampleBSABSABSASMPSMPSMPGelatinGelatinGelatinPositiveWhey0.8581.0001.0260.9701.0100.8490.6630.9230.760阳性乳清NegativeWhey0.1030.1070.1060.1000.1000.0950.1020.1100.107阴性乳清P/N8.3309.3179.7109.92010.608.9376.4798.3667.1033.3.5最佳封闭时间用含5%脱脂奶粉的PBST作为封闭剂，37℃分别作用30min、60min、90min、120min。37℃封闭60min时P/N值最大，如表3-4所示。确定最佳封闭时间为60min。表3-4最佳封闭时间的确定Table3-4DeterminationoftheoptimalblockingtimeOD630nmvaluesSample30min60min90min120min阳性乳清/Positivewhey1.0271.0961.0831.140阴性乳清/Negativewhey0.1530.1540.1540.179P/N6.7127.1177.0326.3693.3.6最佳乳汁作用时间乳汁在37℃分别作用30min、60min、90min、120min，试验结果如表3-5所示，乳汁作用60min时P/N值最高。确定乳汁最佳反应时间为60min。表3-5最佳一抗反应时间Table3-5OptimizationofmilkreactiontimeOD630nmvaluesSample30min60min90min120min阳性乳清/Positivewhey1.2961.4781.4051.523阴性乳清/Negativewhey0.1970.1990.2410.257P/N6.5907.4385.8205.9183.3.7最佳酶标抗体作用时间加入酶标抗体之后，37℃分别作用30min、45min和60min，如表3-6所示，酶标抗体作用45min时P/N值最高。确定酶标抗体最佳作用时间为45min。26万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用表3-6最佳二抗反应时间Table3-6OptimizationofIgA-HRPreactiontimeOD630nmvaluesSample30min45min60min阳性乳清/Positivewhey0.7671.0831.085阴性乳清/Negativewhey0.1430.1780.193P/N5.3646.0845.6223.3.8阴阳性临界值将50份阴性样品使用本试验建立的方法检测，剔除2份阳性样品，得出48份阴性样品的OD630nm值，结果如表3-7所示。阴性样品的平均值(X)为0.175，标准偏差(SD)为0.052。根据统计学原理，阳性样品检测下限为平均值(X)+3SD=0.331，即OD630nm值≥0.331判定为阳性。当OD630nm值≤平均值(X)+2SD，即OD630nm值≤0.279判定为阴性，介于两者之间为可疑。表3-7阴性样品的ELISA检测结果Table3-7DetectionresultsofthenegativemilkSampleNo.OD630nmvalues01~060.2090.1360.2380.1570.1120.14607~120.1720.1770.1870.1060.2060.17913~180.1420.1890.1650.1910.2180.16119~240.1320.1700.2120.1440.1890.23425~300.1270.2940.1470.1310.1810.12331~360.1430.2140.1240.2030.3030.37537~420.1920.1260.1410.1740.1440.12142~480.1580.1180.1440.1630.1640.2143.3.9重复性试验3.3.9.1批内重复试验将5组阳性样品和1组阴性样品分别用同一批次包被的抗原包被板在6个时间点检测，结果如表3-8所示，批内重复试验的变异系数CV均值为2.1%~8.6%。27万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文表3-8批内重复试验Table3-8Resultsofinter-batchreproducibilitytestOD630nmvaluesGroupS15C9F2F5C5Negative10.4961.3761.6632.5710.8340.14320.4731.3031.6682.4300.9530.15930.5091.2641.5192.4410.9190.17040.4901.2911.5872.490.8700.15650.4871.2501.5972.5310.8330.13360.4831.1921.5762.5040.8490.147SD0.0120.0610.0560.0540.0490.013Average0.4901.2791.6022.4950.8760.151CV/%2.50%4.80%3.50%2.10%5.60%8.60%*S15，C9，F2，F5，Ｃ5为阳性样品3.3.9.2批间重复试验将5组阳性样品和一组阴性样品分别用4个批次蛋白包被的抗原包被板检测，结果如表3-9所示，批间重复试验的变异系数均值为2.3%~5.1%。表3-9批间重复试验Table3-9Resultsofintra-batchreproducibilitytestOD630nmvaluesGroupC2C11C15C13C3Negative10.951.0091.6471.7422.0250.12620.9041.0621.5881.7612.1940.13230.9341.0031.5661.6812.0510.11840.9940.9881.5451.7712.2240.12SD0.0380.0320.0440.040.10.006Average0.9461.0161.5871.7392.1240.124CV/%4.00%3.20%2.80%2.30%4.70%5.10%*C2，C3，C11，C13，C15为阳性乳汁3.3.10敏感性试验使用本方法检测6头后海穴免疫灭活疫苗的母猪乳汁的猪流行性腹泻IgA抗体，结果如表3-10所示，母猪分娩后乳汁中的猪流行性腹泻IgA抗体以0d时，即初乳中最高，随着日龄的增加抗体水平逐渐降低，在母猪产后21d的乳汁中仍可检出猪流行性腹泻IgA抗体。取6组乳汁抗体平均值建立抗体变化曲线，如图3-2所示。5份阳性乳汁样品分别做6个梯度稀释，其它条件按照最佳反应条件进行，结28万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用果如表3-11所示。当乳汁为1:240倍稀释时，仍然可以检出阳性。表3-10免疫母猪乳汁IgA抗体变化规律Table3-10DynamicofIgAantibodiesinimmunesowmilkOD630nmvaluesSample0d3d7d14d21d11.0231.3030.4070.4670.35621.4631.2700.6680.6390.50730.8250.8970.7600.6990.72541.4090.4001.1070.6640.22451.3050.6460.5770.6520.86461.0161.1330.9510.5640.659Average1.174±0.2550.942±0.3630.745±0.2540.614±0.0850.556±0.239图3-2母猪乳汁PEDV-IgA抗体变化曲线Fig.3-2DynamiccurveofPEDV-IgAantibodiesinsow’smilk表3-11样品稀释Table3-11ResultsofsensitivitytestOD630nmvaluesofdifferentdilutionsSample1:301:601:1201:2401:4801:960A1.7941.3710.9530.5070.2190.143B1.3100.8380.5290.4280.1230.095C2.1471.6310.9740.5160.2550.141D2.0241.4121.0470.7350.4600.241E1.6951.2720.8850.4480.2690.172Positive1.4751.0030.5360.3340.2780.131Negative0.0740.0790.0670.0720.0610.0713.3.11比较试验453份乳汁样品使用本试验方法检测，阳性检出率为81.9%（371/453）阴性检出率为18.1%(82/453)；使用韩国BIONOTE公司生产的IgA抗体检测试剂盒检测，阳性检出率为81.46%（369/453），阴性检出率为18.54%（84/453），结果如表3-1229万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文所示。以BIONOTE公司IgA检测试剂盒为标准，本试验建立方法的灵敏度为95.6%，特异度为82.1%，两种检测方法的总符合率为93.8%；本实验方法的阳性预测值为95.96%，阴性预测值为84.15%。表3-12对比试验Table3-12ContrasttestoftwodifferentmethodsBIONOTEIgAAbELISAPositiveNegativeTotalPositive/阳性35615371Negative/阴性136982Total/合计36984453IndirectPositivepredictivevalue95.96%IgAAb阳性预测值ELISANegativepredictivevalue84.15%阴性预测值Sensitivity/灵敏度96.50%Specificity/特异度82.10%Coincidence/总符合率93.80%3.3.12乳汁IgA抗体水平与仔猪腹泻关系的评估腹泻组的母猪编号为9号、10号、18号；正常组的母猪编号为6号、7号、15号，各个时间段抗体检测结果如表3-13所示。腹泻组和正常组母猪乳汁IgA抗体随着仔猪日龄的增加而逐渐降低，腹泻组21d抗体水平波动上升，腹泻组乳汁IgA抗体水平整体水平低于正常组，见图3-3。表3-13PEDV-IgA抗体水平与腹泻的关系Table3-13RelationshipbetweendiarrheaandPEDV-IgAantibodylevelsdiarrheanormalTime18109Average6715Average0d0.8910.6881.2150.931±0.2661.3021.3411.0201.221±0.1753d0.5050.5310.9210.652±0.2331.0131.0550.6810.916±0.2057d0.5520.5920.5220.555±0.0350.8840.8670.5660.772±0.17914d0.3950.4660.6770.513±0.1470.7160.5560.6580.643±0.08121d0.8740.5840.8940.784±0.1730.6060.5210.5040.544±0.05530万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用图3-3PEDV-IgA抗体水平与腹泻的关系Fig.3-3RelationshipbetweendiarrheaandPEDV-IgAantibodylevels3.3.13疫苗免疫后IgA抗体对比试验口服猪流行性腹泻减毒沙门氏菌基因工程疫苗组和注射市售灭活疫苗组抗体对比试验发现，如表3-14所示，口服疫苗组母猪乳汁的猪流行性腹泻IgA抗体平均值显着高于注射灭活疫苗组。表3-14疫苗对比试验Table3-14ContrasttestoftwodifferentvaccinesSampleNo.ofSampleNo.ofOD630nmvaluesOD630nmvaluessalmonellaOralvaccineinactivatedvaccine21.26170.5580.487110.591.728120.383101.06250.64829400.70733010.697Average1.049Average0.5563.4小结与讨论本试验以纯化的猪流行性腹泻病毒S1D蛋白为抗原，建立了检测母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体的间接ELISA方法。重复试验表明，批内重复性试验变异系数在2.1%~8.6%之间，批间重复试验变异系数在2.3%~5.1%之间，证明该方法有较好的重复性。当乳汁稀释到240倍时，阳性乳汁和临床样品均能检测出阳性，453份乳汁样品用本试验方法与韩国BIONOTE公司IgA抗体检测试剂盒进行对比，本试验方法灵敏度96.5%，特异度82.1%，两种方法的符合率为93.82%，表明本方法有较高的灵敏度和特异度。免疫母猪乳汁中猪流行性腹泻IgA抗体以初乳中最高，随着时间的增加，乳汁中抗体逐渐降低。对临床仔猪腹泻后母猪IgA抗体的监测发现，腹泻组母猪的PEDV-IgA抗体整体低于正常组，但是后期有一个波动上升的趋31万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文势，从抗体的角度推断仔猪随粪便排出的PEDV感染母猪，导致母猪机体猪流行性腹泻IgA抗体的暂时上升。本实验所用PEDV减毒沙门氏菌基因工程疫苗是将猪流行性腹泻病毒两个免疫原性基因片段，COE和S1D基因电转入vasdC500缺失株中，构建了包含猪流行性腹泻病毒的免疫原性基因片段COE基因和SD基因的重组沙门氏菌菌株C501-COE和C501-SD。PEDV的COE基因和S1D基因能在重组菌中稳定存在和表达，具有很好的遗传稳定性。在疫苗免疫对比试验中，使用猪流行性腹泻减毒沙门氏菌疫苗组的母猪PEDV-IgA抗体水平明显高于肌注灭活疫苗组，表明口服疫苗产生的黏膜免疫对提高母猪乳汁IgA抗体水平起到更加有效的作用。黏膜免疫在病毒性腹泻的免疫防御机制中具有十分重要的作用（陈建飞等，2010）。肠道黏膜形成的分泌型IgA抗体能抵御外源病原体的入侵。口服疫苗能够直接到达肠道，刺激肠道的黏膜免疫，产生的保护性IgA抗体，可以直接中和病毒，降低病毒的侵染性。该途径是仔猪抵御肠道传染病的有效途径（LusuardiMetal，2002）。当前应用于国内猪群的猪流行性腹泻疫苗以灭活疫苗为主，鉴于猪流行性腹泻有明显的肠嗜性，通过口服疫苗免疫，激发肠道黏膜免疫特别是产生黏膜免疫，为预防该病提供了新的思路（杨德全等，2013）。一般认为理想的抗体水平与疫苗的保护率成正相关，但目前临床发病猪群流行性腹泻抗体检测发现，免疫猪群中有较高的IgG抗体，但猪群仍然发生腹泻（SalmonHetal，2000）。因此传统检测IgG抗体水平因不能全面反映肠道黏膜免疫状况，从疫苗免疫角度考虑，IgG抗体评价疫苗保护的方法存在一定的缺陷(许宝华等，2012)。目前国内没有猪流行性腹泻IgA抗体检测试剂盒的报道，因此本试验首次建立了猪流行性腹泻IgA抗体ELISA检测方法，为临床猪流行性腹泻IgA抗体的评估和疫苗免疫效力的评价奠定了基础。32万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用4.猪流行性腹泻IgG抗体间接ELISA检测方法的建立4.1材料4.1.1主要试剂和仪器辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG购于AbDSerotec公司；TMB底物显色液购于武汉科前动物生物制品有限公司；96孔酶标板为corning公司产品；Theromo-MK3型酶标仪购自赛默飞世尔（上海）有限公司；PED阳性血清样品和阴性血清样品为本实验室保存；其他化学试剂为分析纯。4.1.2ELISA相关试剂的配制包被液:25mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)；Na2CO3(1.59g)，NaHCO3(2.93g)，ddH20加至1000ml；洗涤液:含0.05%Tween-20的PBST(pH7.2~7.4)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，.Na2HPO412H2O(2.9g)，KH2PO4(0.2g)，Tween-20(0.5ml)，ddH20加至1000ml；封闭液:0.5g溶于100ml洗涤液。稀释液:0.1gBSA溶于100ml洗涤液。4.2试验方法4.2.1免疫荧光试验检测阳性血清中的IgG抗体用于免疫荧光试验的96孔病毒细胞板制备过程同3.2.2。分别将免疫母猪血清和未免疫母猪血清做1:40倍稀释，100μL/孔加入96孔板，各做2孔重复；在37℃恒温箱孵育30min。用PBS溶液洗涤，200μL/孔，摇床放置5min，甩干，重复3次。加入1:60倍稀释的FITC兔抗猪IgG荧光二抗，在37℃温箱培养30min。洗涤同上；荧光显微镜下观察记录结果。4.2.2抗原最佳包被浓度和血清稀释度的选择采用棋盘滴定法，以磷酸盐缓冲液为稀释液将纯化的S1D蛋白稀释至终浓度为8µg/mL，4µg/mL，2µg/mL，1µg/mL，0.5g/mL，每个浓度包被两列，每孔包被100µL，4℃包被过夜。PBST洗涤液洗涤5次，每次3min，洗涤后拍干，PBST洗涤液为含33万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文0.05%Tween-20的0.01mol/L的PBS，pH7.4。加入含0.5%（w/v）牛血清白蛋白(BSA)的PBST，每孔200µL，37℃封闭2h，洗涤同上。洗涤后拍干备用。将阴、阳性血清分别按1:20，1:40……，1:320，1:640梯度稀释后加入ELISA板，100µL/孔，37℃作用1h，取出后洗涤同上。拍干后加入1:6000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG酶标二抗，每孔100µL，37℃反应30min，洗涤同上。洗涤后加入TMB底物液，100µL/孔，37℃避光反应10min。加入2mol/L硫酸50µL/孔，终止反应，于酶标仪630nm波长读数。以阳性血清OD值接近1，P/N值最大孔的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。4.2.3抗原最佳包被时间的选择以最适抗原包被浓度4种不同条件包被酶标板:4℃过夜；37℃孵育30min，4℃过夜；37℃孵育60min，4℃过夜；37℃孵育90min，4℃过夜；37℃孵育120min，4℃过夜。包被完成后，其他步骤同3.2.3。比较各组阴、阳性血清P/N值，以选择最佳包被时间。4.2.4最佳封闭液的选择以4.2.2确定的抗原最佳包被浓度包被酶标板，封闭液分4组，分别为1µg/mLBSA，10µg/mL脱脂奶粉（SMP），1µg/mL明胶（Gelatin），每组封闭液用PBST倍比稀释为4个稀释度。每孔加入200µL封闭液，37℃封闭1h。封闭完成后，血清按照最佳稀释度加入，其他步骤同4.2.2。比较各组阴、阳性血清的P/N值以选择最佳封闭液。4.2.5最佳封闭时间的选择以最适抗原浓度包被酶标板，用4.2.3中已确定的最佳封闭液封闭酶标板，封闭时间分成4组，分别为37℃孵育30min，60min，90min，120min，封闭完成后，血清按照确定的最佳稀释度加入，其他步骤同1.2.2。比较各组阴、阳性血清P/N值，以选择合适的封闭时间。4.2.6最佳一抗作用时间的选择按照优化的条件进行包被、封闭后，血清按照确定的最佳稀释度加入，37℃分别作用30min，60min，90min，120min，其他步骤同1.2.2。比较各组阴、阳性血清P/N值，以选择合适的血清作用时间。34万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用4.2.7最佳酶标抗体作用时间的选择将酶标抗体按照推荐的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用30min，45min，60min，75min，90min。其他步骤同4.2.2，比较各组阴、阳性血清的P/N值，以选择合适的酶标抗体作用时间。4.2.8临界值的确定取30份间接免疫荧光（IFA）鉴定的阴性血清，在优化条件下检测血清OD630nm值，计算样品OD630nm值的平均值(X)和标准差(SD)，根据统计学原理，样本的OD630nm值≥平均值(X)+3SD时，判为阳性，OD630nm值≤平均值(X)+2SD时，判为阴性，介于二者之间者判为可疑。4.2.9重复试验4.2.9.1批内重复试验将同一批次纯化的蛋白包被ELISA板，取5组不同抗体水平的阳性血清样品和1组阴性样品，每组样品-20℃分装冻存为6份，于6个不同时间点分别进行ELISA检测，统计检测结果并计算标准差、平均值和变异系数。4.2.9.2批间重复试验用不同批次制备的4批蛋白抗原分别包被ELISA板，取5组不同抗体水平的阳性样品和1组标准阴性样品进行ELISA检测，统计检测结果并计算标准差、平均数值和变异系数。4.2.10疫苗免疫对比试验选取两种市售疫苗免疫12头100日龄左右的育肥猪，分为两组：TB组合HL组，每组6头，分别注射TB和HL两种猪流行性腹泻灭活疫苗，于免疫前（0d）、免疫后15d、免疫后30d分别采集血液，每头每次2mL，分离血清-20℃冻存备用。将采集的血清使用本试验建立的猪流行性腹泻IgG抗体检测方法检测。分析疫苗免疫后抗体变化情况。35万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文4.2.11哺乳仔猪猪流行性腹泻IgG抗体的变化选取6头试验母猪，每窝选取2头仔猪，编号；仔猪在产后7d、14d、21d采集血液，每头1mL，分离血清。样品于-20℃冻存备用。将采集血清使用本试验建立的方法检测猪流行性腹泻IgG抗体。对比各阶段抗体水平，以期得到哺乳仔猪血清猪流行性腹泻IgG抗体变化情况。4.3结果与分析4.3.1免疫荧光试验检测阳性血清中的IgG抗体图4-1血清PEDV-IgG抗体IFA实验C：免疫母猪血清；C1：A孔细胞自然光对照D:未免疫母猪血清；D1：B孔细胞自然光对照Fig.4-1IFAtestofPEDV-IgAantibodyinsowmilkC:Serumofvaccinatedsows；C1：ControlcellsinCholeinnaturallightD:Serumofun-vaccinatedsows；D1:ControlcellsinCholeinnaturallight4.3.2抗原最佳包被浓度和血清稀释度棋盘滴定结果如表4-1所示，当抗原包被浓度为2µg/mL，血清稀释倍数为1:40时，阳性血清OD630nm值接近1，且此稀释度的P/N值最大。因此最佳抗原包被浓度确定为2µg/mL，最佳血清稀释倍数为1:40。36万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用表4-1棋盘滴定的OD630nm结果Table4-1TheOD630nmofcheckerboardtitrationOD630nmvaluesSampleDilution8µg/mL4µg/mL2µg/mL1µg/mL0.5µg/mL1:201.8121.5321.2030.7530.5581:401.5611.2761.0670.7420.456阳性血清1:801.3331.0830.8010.3990.280Positiveserum1:1600.9840.7910.5810.3560.2341:3200.7160.5290.3670.2220.1571:6400.5010.4080.2780.1940.1381:200.1480.1410.1270.1130.1051:400.1170.1270.1250.1060.106阴性血清1:800.1160.1340.1330.1050.113Negative1:1600.1050.1330.1280.1140.115Serum1:3200.1020.1320.1240.1180.1071:6400.1090.1300.1220.1080.1254.3.3最佳抗原包被条件用最佳包被浓度进行抗原包被，通过不同的时间包被抗原，发现37℃孵育60min，4℃过夜时P/N最大（见表4-2），确定37℃，60min，4℃过夜为抗原的最佳包被条件。表4-2抗原最佳包被时间的选择Table4-2Resultsoftheoptimaltimeforcoatingofrecombinantprotein4℃37℃，30min，37℃，60min，37℃，90min，37℃，120min，Sampleovernight4℃overnight4℃overnight4℃overnight4℃overnight阳性血清0.7901.0561.2281.1971.279Positiveserum阴性血清0.0990.1130.1200.1240.130Negativeserump/N7.9539.31810.2319.6779.8614.3.4最佳封闭液用不同封闭液对包被的酶标板进行封闭，结果如表4-3所示，0.5%的BSA作为封闭液时P/N值最大。确定0.5%BSA为最佳封闭液。37万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文表4-3最佳封闭液的选择Table4-3ResultsoftheoptimalblockingsolutionBSASMPSample2%1%0.50%0.25%8%4%2%1%阳性血清Positiveserum1.2001.2431.4051.4491.0000.9921.0231.046阴性血清Negativeserum0.0850.0940.0920.0980.0800.0780.0730.081P/N14.17713.26715.32414.8413.212.66814.0812.909GelatinCalfserumSample2%1%0.50%0.25%2%1%0.50%0.25%阳性血清Positiveserum1.0401.1001.1311.1441.1001.0911.1351.208阴性血清Negativeserum0.1010.1010.1140.1060.0900.0900.0900.091P/N10.29410.8889.92110.8312.212.12212.6113.2714.3.5最佳封闭时间用含2%脱脂奶粉的PBST作为封闭剂，37℃分别作用30min、60min、90min、120min。试验结果如表4-4所示，37℃封闭60min时P/N值最大。确定最佳封闭时间为60min。表4-4最佳封闭时间的选择Table4-4ResultsoftheoptimalblockingtimeOD630nmvaluesSample30min60min90min120min阳性血清/Positiveserum1.2021.3091.3631.201阴性血清/Negativeserum0.1050.1110.1190.106P/N11.44811.75711.48611.334.3.6最佳血清作用时间血清在37℃分别作用30min、60min、90min、120min，试验结果如表4-5所示，血清作用60min时P/N值最高。确定血清最佳反应时间为60min。表4-5最佳一抗反应时间Table4-5OptimizationofserumreactiontimeOD630nmvaluesSample30min60min90min120min阳性血清/Positiveserum1.3051.3391.3241.272阴性血清/Negativeserum0.0630.0580.0560.057P/N20.71423.2223.50322.44738万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用4.3.7最佳酶标抗体作用时间加入酶标抗体之后，37℃分别作用30min、45min和60min，试验结果如表4-6所示，酶标抗体作用45min时P/N值最高。确定酶标抗体最佳反应时间为45min。表4-6最佳二抗反应时间Table4-6OptimizationofIgG-HRPreactiontimeOD630nmvaluesSample30min45min60min75min90min阳性血清/Positiveserum1.1521.4911.6771.7151.747阴性血清/Negativeserum0.0650.0660.0730.0750.082P/N17.72322.59122.97322.86721.3054.3.8阴阳性临界值将30份阴性样品使用本试验建立的ELISA方法检测，（见表7），计算其平均值(X)为0.112，标准偏差(SD)为0.029。根据统计学原理，阳性样品检测下限为平均值(X)+3SD=0.197，即OD630nm值≥0.197判定为阳性。当OD630nm值≤平均值(X)+2SD即OD630nm值≤0.169判定为阴性，介于两者之间为可疑。表4-7阴性样品的ELISA检测结果Table4-7DetectionresultsofthenegativeserumSampleNo.OD630nmvalues01~060.1080.1310.0970.1120.1510.08207~120.1120.1770.1090.1200.0900.09613~180.1260.0900.0760.1240.0910.11119~240.0840.0740.0870.1630.1070.09325~300.1290.1400.1320.1730.0720.0924.3.9重复性试验4.3.9.1批内重复试验将5个阳性样品和1个阴性样品分别用同一批次包被的抗原包被板在5个时间点检测，结果如表4-8所示，批内重复试验的变异系数为2%~5.4%。39万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文表4-8批内重复试验Table4-8Resultsofinter-batchreproducibilitytestSampleOD630nmvaluesNo.12345Negative10.5841.2550.6771.7561.0200.10120.6011.1410.6921.7740.9970.10830.6121.2460.7231.6920.9810.09940.5931.2570.7391.7330.9650.10650.6271.2400.6811.7011.1050.097SD0.0170.0490.0270.0350.0550.005Average0.6031.2280.7021.7311.0140.102CV/%2.80%4.00%3.90%2.00%5.40%4.60%4.3.9.2批间重复试验将5个阳性样品和1个阴性样品分别用5个批次蛋白包被的抗原包被板检测，结果如表4-9所示，批间重复试验的变异系数均值为3.1%~5.5%。表4-9批间重复试验Table4-9Resultsofintra-batchreproducibilitytestSampleOD630nmvaluesNo.12345Negative10.6971.0371.0120.7980.8560.10320.6751.0451.1310.7990.8420.10730.7301.1061.1610.8990.8760.11640.6801.0111.1070.8170.8560.11350.6921.1231.1270.7910.8060.104Average0.6951.0641.1080.8210.8470.109SD0.0220.0480.0570.0450.0260.006CV/%3.10%4.50%5.10%5.50%3.10%5.20%4.3.10疫苗免疫对比试验将疫苗免疫前后搜集的TB组和HL组血清使用本方法建立的猪流行性腹泻IgG抗体检测方法检测，结果如表4-11所示。40万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用表4-11免疫猪IgG抗体的检测Table4-11IgGantibodydetectionofImmuneswineTBgroupOD630nmvaluesHLgroupOD630nmvaluesSampleNo.0d15d30dSampleNo.0d15d30dT10311.2741.4091.467H191121.1361.2871.239T19860.9320.9960.860H19220.9021.3881.065T17270.9731.3271.248H19351.1451.2321.112T17771.0391.3141.319H17021.4721.3291.571T19020.9121.4211.437H18901.1961.1441.098T17981.0261.4251.254H188121.6461.8181.671Average1.026±0.1311.315±0.1641.264±0.218Average1.25±0.2661.366±0.2361.293±0.263将两组试验猪不同日龄血清的IgG抗体值取平均值，建立猪流行性腹泻疫苗免疫前后抗体变化曲线如图4-1所示。图4-1PEDV-IgG抗体变化曲线Fig.4-1GrowthanddeclinecurveofIgGantibodies4.3.11哺乳仔猪猪流行性腹泻IgG抗体的变化哺乳仔猪血清抗体检测检测结果如表4-12所示。将各个时间段猪只检测的抗体取平均值和标准差建立猪流行腹泻抗体的变化曲线如图4-2所示；仔猪IgG抗体随着日龄的增加而逐渐的降低，最后都趋于平稳。IgG抗体在7d以后有一个明显的下降趋势，14d~21dIgG抗体水平处于较低水平，且趋于平稳。表4-12仔猪猪流行性腹泻IgG抗体监测试验Table4-12MonitoringtestofpigletIgGantibodiesOD630nmvaluesofdifferentsamplesTimeNo.1No.2No.3No.4No.5No.6Average0.7050.4190.8050.7371.0190.6517d0.738±0.1970.7640.4581.0400.8290.6050.5250.3550.1060.4130.1470.0760.30914d0.260±0.1610.4340.1290.5530.1070.1390.3560.6030.260.1190.2980.0830.12421d0.259±0.1870.6380.2730.1130.2620.0820.24741万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文图4-2猪流行性腹泻IgG抗体变化曲线Fig.4-2MonitoringtestofIgGantibodies4.4小结与讨论本试验以纯化的猪流行性腹泻病毒S1D蛋白为抗原，建立了检测PEDV血清IgG抗体的间接ELISA方法。重复试验表明，批内重复性试验变异系数在2%~5.4%之间，批间重复试验变异系数在3.1%~5.5%之间，证明该方法有较好的重复性。当血清稀释到640倍时，阳性和临床样品均能检测出阳性，表明本方法有较高的敏感性。稳定性试验中，目前已经完成蛋白板的包被，放置在4℃条件下，每隔30d检测一次，观察检测的稳定性；另外，后期将在不同的环境条件下检测，以观察不同环境条件对本实验方法的影响。疫苗免疫后，猪流行性腹泻IgG抗体变化试验可知，抗体出现的峰值在0d~15d，并且在15d~30d出现缓慢下降的趋势，提示在15日龄左右可能是灭活疫苗免疫的有效时期。目前实验室建立的猪流行性腹泻IgG抗体ELISA检测方法多为全病毒包被，全病毒制备抗原可能存在潜在散毒的风险，本试验建立的ELISA检测方法是一种安全、稳定、制备方便且特异性和重复均高的诊断方法，可以应用于临床大量样品抗体的检测。由仔猪的抗体变化趋势推测仔猪出生后到7日龄期间出现猪流行性腹泻IgG抗体的峰值，但是随着7d~14d母猪乳汁中抗体水平的降低，仔猪体内的抗体也有一个降低的过程。这是由于新生仔猪免疫系统发育不完善，前期自身产生抗体的能力弱，主要通过母源抗体获得免疫保护。另外，目前临床流行毒株和疫苗株交叉保护不强，因此建立一种能区分疫苗毒株和流行毒株的血清学检测方法对临床防治猪流行性腹泻病同样具有重要的实践意义。42万方数据 猪流行性腹泻病毒IgA、IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用5.全文结论（1）PEDVS1D基因序列与DR13、JS-2004-2、KNU-0801、DX、LZC、CV777、BrF87和Chinju99的核苷酸序列同源性分别为99%、97%、98%、97%、96%、97%和97%。这充分说明了本研究所选择的S1D基因，在各毒株之间同源性很高，且保守性较好。因此使用S1D蛋白可以用于不同PEDV毒株间IgA和IgG抗体检测。(2)本研究将表达质粒pET-32a-S1D在E.coliBL21中成功表达，得到了猪流行性腹泻S1D蛋白，S1D蛋白主要在菌液的包涵体中表达，且具有良好的反应原性，可以作为建立猪流行性腹泻抗体检测的包被抗原。（3）本研究建立了母猪乳汁猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法，本方法重复性好，特异性强，敏感性高。可以用于母猪的猪流行性腹泻IgA抗体的评估。（4）本研究建立了猪流行性腹泻IgG抗体间接ELISA检测方法，本方法重复性好，特异性强，敏感性高。为临床血清IgG抗体的评估建立了基础。（5）本研究证实了母猪乳汁中的猪流行性腹泻IgA抗体与仔猪腹泻具有相关性。仔猪发生腹泻的母猪群，其乳汁中的猪流行性腹泻IgA抗体明显低于仔猪正常组的母猪；（6）本研究通过对比试验证实，口服猪流行性腹泻减毒沙门氏菌基因工程疫苗的母猪，其乳汁中的PEDV-IgA抗体水平明显高于注射灭活疫苗组。表明口服免疫途径在刺激机体产生黏膜免疫分泌IgA抗体方面有其独特的优势，其免疫方式更加方便，为未来猪流行性腹泻疫苗的开发和应用提出了新的思路。43万方数据 华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文参考文献1.薄清如,猪流行性腹泻的病理学研究-免疫酶组化法（间接法）抗原定位的研究.畜牧兽医学报[J],1989,增刊（2）：101.2.陈建飞，冯力等.猪流行性腹泻疫苗的研究[J].猪业科学，2010,12:50~51.3.陈茹，罗琼，李树根，黄侠芳.间接法Dot-ELISA检测猪流行性腹泻抗体的研究[J].中国兽医杂志，1997，23（8）：10~13.4.崔现兰,马思奇,王明,等.应用免疫荧光法诊断猪流行性腹泻的研究[J].中国畜禽传染病,1990,5:19~24.5.邓祖丽颖，陈陆.猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国畜牧兽医,2014,41(1):34~37.6.丁振江，万胜锋，等。规模化猪场猪流行性腹泻的诊断与防控探索[J].养猪，2013，4（6）：101~103.7.董丽娜,高凤山,许崇波,等.表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J].畜牧兽医学报,2008,39(12):1743~1747.8.董彦鹏，白娟，范宝超，李玉峰，姜平.猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2013，35（7）：555~558.9.高慎阳,邹运明,李一经.猪流行性腹泻病毒M基因及其片段原核表达效果分析[J].中国预防兽医学报.2007,29（1）:28~30.10.葛俊伟,姜艳平,汪淼,等.表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J].生物工程学报,2009,25(6):813~818.11.韩蓉,时晓丽,赵攀登,等.猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用[J].畜牧与兽医,2013,45(2).12.姜厚涛,吴国华,张强,等.动物黏膜免疫的研究进展[J].中国兽医科学,2013,43(6):655~660.13.李建强,柳纪省,兰喜,等.猪流行性腹泻病毒纤突蛋白基因克隆与序列分析[J].农业生物技术学报.2007,15(04):562~566.14.林志雄，季树根，李力复，陈茹，昆周.猪流行性腹泻微血清中和试验的建立和应用[J]．中国兽医科技，1994，24(11):3~4．15.刘邓,袁秀芳,冉多良,等.TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用[J].中国动物传染病学报，2010，18（1）:28~33.44万方数据 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华中农业大学2014届专业学位硕士毕业论文致谢时光飞逝，研究生生涯已接近尾声。值此论文付梓之际，感谢我的导师何启盖教授在学习和生活上无微不至的关怀。两年来导师不仅在科研创新方面给予我指导、鼓励和支持，让我在无数次迷茫中坚持；更是在生活中教导我做人的道理，让我受益终身。在此致以我最衷心的感谢！感谢陈焕春院士、吴斌教授、方六荣教授、肖少波教授、刘正飞教授、彭贵青教授、周锐教授、曹胜波教授、贝为成教授、蔡旭旺副教授、陈品老师、孟宪荣老师等在我研究生学习期间给予的大力支持和帮助，感谢农业微生物学国家重点实验室的各位老师和工作人员，为我们提供了良好的试验平台和技术支持，在此向他们致以诚挚的谢意。感谢实验室李文涛、刘英玉、程爽、胡翰、余腾、叶十一、陈芳洲、万胜锋、邓凤、AttaMuhammadMemon(阿达)博士和库旭钢、王晓飞、刘冲、冷章明、张恒玲、王玄珂、吴奇英、郭效珍、张佳思、李中华、闫贵伟、陈淑华、杨子靖、凌云志、张明辉、郭楠、马海龙、李梦莹等硕士研究生在我的试验期间给予的关心和帮助，是你们无私的帮助使我的课题研究更加顺利的完成，也让我的研究生生活充满了快乐的回忆。感谢刘晓丽、严伟东、张平、赵洪翠、覃练温、姚丽等实验室工作人员的热情帮助。感谢雷卫强、杨新、刁佳亮、樊杰、牛敏、刘英娟、朱仕轩、彭龙、王波等硕士在我研究生生活中给予的帮助，在此对他们一并表示感谢。最后衷心地感谢我的家人、朋友，你们的关心和支持永远是我前进的动力！丁振江2014年6月9日50万方数据