建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法-论文.pdf

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1、第37卷第z期辽宁师范大学学报(自然科学版)Vo1．37NO．22014年6月JournalofLiaoningNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Jun．2014文章编号：1000—1735(2014)02—0252—06doi：10．11679／lsxb1k2O14O2O252建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法刘冉，赵玉琢，孙铭英，曹际娟(辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001)摘要：建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonellagalli—narum)的方法．根据G

2、enBank公布的鸡伤寒沙门氏茵基因序列，设计引物和Taqman探针，采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验．结果表明：特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌．以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释茵液DNA为模板进行实时荧光PCR实验，菌株模板浓度与C值呈良好线性关系，线性系数(尺)为0．999，扩增效率为88．2，最低检测浓度为5cfu／mL．对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定，两者结果一致．该方法特异性好、灵敏度高，是快速鉴定鸡伤寒沙门

3、氏菌的有效方法．关键词：实时荧光PCR；鸡伤寒沙门氏茵；快速鉴定中图分类号iQ93-331文献标志码：A鸡伤寒是由鸡伤寒沙门氏菌(Salmonellagallinarum)引起的家禽败血性传染病，主要发生于鸡和火鸡．病程为急性或慢性经过．鸡伤寒呈世界性分布，由该病造成的损失很严重，导致鸡的死亡率可达1O～5O或更高，养鸡户们最不想看到的就是鸡得伤寒．因此，建立快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的方法，对于病情早期诊断、预防与控制具有重要意义．鸡伤寒沙门氏菌的检测主要是依靠传统培养的方法，该方法需选择性增菌培养、生化鉴定、血清分型，通常要5～6d才能得出检测结果，不利于及时诊断、查

4、找病源，控制病情的蔓延．本研究根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌的基因序列，设计引物和Taqman探针，特异性扩增鸡伤寒沙门氏菌，并评价实时荧光PCR扩增体系的特异性、敏感性、扩增效率以及与传统检测方法的符合性，期望为鸡伤寒的早期诊断提供技术保障．1材料和方法1．1试验菌株不同血清型的沙门氏菌共6O株，其中1株鸡伤寒沙门氏菌标准菌株(CMCC50770)，33株鸡伤寒沙门氏菌分离株，26株其他血清型沙门氏菌；7株单增李斯特菌等非沙门氏菌菌株．具体菌株信息见表1．上述菌株均采用API20E试剂条和血清学试验进行确证．收稿日期：2014—03—31基金项目：辽宁省自然

5、科学基金项目(20102080)；国家科技支撑计划项目(2011BAK10B02)作者简介：刘冉(1968一)，女，辽宁大连人，辽宁出入境检验检疫局高级工程师，硕士．E—mail：liuran_lr@126．COrn通讯作者：曹际娟(1968一)，女，吉林通化人，辽宁出入境检验检疫局研究员，博士．E—mail：eaojijuanlneig@163．corn第2期刘冉等：建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏茵的方法253表1茵株信息表Table1Informationsheetofstrains254辽宁师范大学学报(自然科学版)第37卷1．2主要仪器和试剂实

6、时荧光PCR(ABI7500，美国)；核酸提取仪(E7001，日本PPS公司)．TTB增菌液、BP缓冲蛋白胨水(北京陆桥有限公司)；PCR用缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP(宝生物工程(大连)有限公司)．1．3引物探针的设计与合成根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌的基因序列，采用Oligo6．0软件设计引物和Taqman探针，特异性扩增鸡伤寒沙门氏菌．引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，序列见表2．表2引物和探针信息表Table2Informationsheetofprimersandprobe1．4DNA提取和特异性试验所有沙门氏菌菌株采用BP缓冲蛋

7、白胨水37℃培养10h，取1OmL接种于TTB增菌液，44．5℃培养18h，取1mL菌悬液移入离心管，12000r／rain离心5min去上清，用1mL去离子水漂浮沉淀，12000r／min离心3min去上清，重复2次，最后加200L去离子水在核酸提取仪上提取DNA，用于实时荧光PCR扩增．非沙门氏菌阴性对照菌株用相应的培养基过夜培养，取1mL菌悬液移入离心管，按上述步骤提取DNA用于实时荧光PCR扩增．所有菌株的DNA用于鸡伤寒沙门氏菌的特异性实验．1．5实时荧光PCR反应体系和参数实时荧光PCR反应体系为3OL，模板DNA1L、10×TaqMan