鸡病毒性关节炎实时荧光RT—PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、·12·《上海畜牧兽医通讯》2014年第4期鸡病毒性关节炎实时荧光RT—PCR检测方法的建立曹琛福刘建利陈兵秦智锋陶虹花群义卢体康(深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心广东深圳518045)【摘要】本文旨在建立实时荧光RT—PCR方法检测鸡病毒性关节炎病原，针对特异性的禽呼肠孤病毒sl基因设计了1对引物及探针，经优化反应体系，确定引物和探针的最优浓度配比，建立了鸡病毒性关节炎实时荧光RT—PCR检测方法。结果显示：该方法灵敏度高、特异性强、检测时间短，可应用于鸡病毒性关节炎的普查监测和检验检疫。关键词：鸡病毒性关节炎；实时荧光RT—PCR方法鸡病毒性关节炎是一种由禽呼肠孤病毒(A

2、vi—司，对照毒株禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏anReovirus，ARV)引起的鸡的重要传染病。病毒囊病病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽白血病病毒均为灭主要侵害关节滑膜、腱鞘和心肌，引起足部关节肿活毒株，为本室保存。临床样本采自深圳某鸡场。胀，腱鞘发炎，继而使腓肠腱断裂。病鸡关节肿胀、1．1．2引物探针的设计：根据GenBank中发炎，行动不便，跛行或不愿走动，采食困难，生长DQ868790．1禽呼肠孤病毒S1133wt株S1基因序停滞。禽呼肠孤病毒主要引起肉鸡发病，偶见蛋鸡列，利用PrimerExpress3．0软件设计了1对引物和火鸡，可水平传播和垂直传播。鸡病毒性关节炎和1条特导

3、性探针。引物及探针序列如下：的感染率和发病率随鸡的年龄越大，敏感性越低，ARVS1_F：5’一CGTTCCCTGTGGACGTAT—1o周龄之后明显降低。病鸡常由于关节炎、腱鞘炎CA一3’造成废弃率高和生长抑制，饲料转化率低，从而引ARVS1一R：5’一GAGTACACCCCATACGC：T—起经济上的较大损失。TGGT一3’禽呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科(Reovirus)正呼ARVS1一P：(FAM)5’一CACCCGCGATTCT—肠孤病毒属(Orthoreovirus)的成员。病毒子呈二GCGACTCATG一3’(ECLIPSE)十面体对称并具有双层衣壳结构，无囊膜，直径约引物及探

4、针由宝生物工程(大连)有限公司合60～80nm，双链RNA，有10个节段，通过其在聚丙成，其扩增目的片段长度为70bp。烯酰胺凝胶电泳上的迁移率不同可分为大(L1一1．2方法I3)、中(M1一M3)、小(S卜S4)三组，编码11个原始1．2．1病毒核酸的制备：按照MagMAXTM-96Vi—的翻译产物。在分子生物学方面，哺乳动物的呼肠ralRNAIsolationKit试剂盒操作要求，制备提取孤病毒研究较多而禽呼肠孤病毒则研究较少，从两样本中所含病毒核酸，立即使用或置一80℃保存者RNA和蛋白质电泳图谱比较分析发现存在显著备用。差异，其中M3和S1基因差异最多。禽呼肠孤1．2．2实时荧

5、光RT—PCR反应体系和条件：实时病毒s1基因研究得较多且较详细，ARV的s基因荧光RT—PCR反应体系母液购自Life公司，产品名编码的外衣壳结构蛋白在ARV复制和感染进程中为AgPath—IDOne—stepRT—PCRKit。取试剂盒发挥重要的作用。本文就是利用s1基因核酸序列中2×PCRBuffer12．5gL，酶混合物1．0gL，加入设计的引物探针，建立了鸡病毒性关节炎病原禽呼适量的引物探针，样品核酸溶液5．0pL，用DEPC肠孤病毒的实时荧光RT—PCR检测方法。水加至总体积25L。按反应母液说明书推荐的反应条件在ABI7500荧光PCR仪上进行反应，具体1材料与方法如下：

6、45℃反转录20min，95℃变性10min，以1．1材料95℃5S、60℃45S扩增40个循环，并收集荧光，1．1．1主要试剂与毒株：核酸抽提试剂盒、实时荧判读结果。光RT—PCR反应母液均购白Life公司，鸡病毒性关1．2．3矩阵法优化引物探针配比：按上述实时荧节炎疫苗毒株(s1133株)购自英特威(Intervet)公光RT—PCR反应体系配制反应液，其中引物(10uM)每条各0．25、0．5、1．0、2．0gL，探针*为通讯作者基金项目：出入境检验检疫行业标准制修订(编号：2011B469r)(10M)选取0．1、0．2、0．4、0．8L进行矩阵式排《上海畜牧兽医通讯》2014

7、年第4期·13·列组合，从而筛选出最优引物探针浓度配比。其总RNA浓度为1．023ng／gI，按10倍梯度稀释1．2．4鸡病毒性关节炎实时荧光RT—PCR检测方成7个梯度，分别采用本文所建立的实时荧光法的特异性实验：分别选取相似临床症状疫病病原RT—PCR方法和ZhixunXieH一文中所用RT-PCR以及几种常见鸡病病原作为对照，对本文建立的实方法进行灵敏度比较。结果显示：本文建立的实时时荧光RT～PCR方法进行特异性实验。提取鸡病荧光RT-