实时荧光pcr和rt

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1、实时荧光PCR和RT：刘建军，古丽巴哈尔，阳帆，陈家敏，何雅青，杨洪【摘要】目的通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用TaqmanMGB技术，根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20%。实时荧光

2、PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论TaqmanMGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。【关键词】登革病毒；RT-PCR；TaqmanGMB实时PCR【Abstract】ObjectiveInordertoimprovethesensitivityandspecificityofdetectingdengueviruses，tethodsfordetectin

3、gdenguevirusesanMGBtechnique，apairofuniversalprimersandTaqmanMGBprobeePCRassayforspecificandsensitivedetectionofthedenguevirusesspecimensofELISApositiveens，2ePCR.Thetestcouldbepletedin4hours.ConclusionTheTaqmanMGBreal-timePCRassayanGMBreal-timePCR登革热是流行于热带、亚热带

4、地区的一种急性虫媒传染病，其病原体为登革病毒，近年来随着全球气候变暖和国际旅游的增多，登革病毒感染呈扩大蔓延之势，发病率不断升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施，因此对该疾病实行早期诊断十分必要。登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组长约11ｋｂ。依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型(ＤＥＮ1～4)［1，2］。登革病毒感染的实验室诊断，传统方法是从患者血清中分离病毒，或用血清学方法检测病毒的特异性抗体。但病毒分离费时，检测血清抗体需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，同时存在广泛的交叉

5、反应而受到干扰［3］，这些均不利于疾病的早期诊断。近年来国内外均有报道应用RT-PCR检测登革热病毒［4］，但RT-PCR方法容易造成污染，同时也存在从临床血清标本中检测登革病毒敏感性不够的问题。这就需要建立一种更敏感、特异和快速的检测鉴定方法，以实现对登革热患者的早期快速诊断，为预防控制登革热的流行赢得时间。本研究比较了利用TaqmanMGB探针技术的实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒特异性，以期选择特异性好、灵敏度高的检测方法，达到快速诊断登革热的目的。1材料与方法1.1毒株及血清标本登革病毒1～4型

6、标准株由广东省疾病预防控制中心提供，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株由成都生物制品所提供。血清标本采自深圳市近几年发病2周内的疑似登革热病人和发病10天内的疑似乙脑病人，-80℃保存。1.2主要试剂病毒RNA提取试剂盒为Roche公司产品，TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、随机引物购自Invitrogen公司，dNTP购自上海生工公司，AMV逆转录酶、RNaseinhibitor购自大连宝生物公司，引物和荧光探针由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。1.3主要仪器设备Ce

7、ntrifuge5415D台式高速离心机购自德国Eppendorf公司，Ultrospec2000紫外可见光蛋白核酸分析仪购自美国GE公司，9700基因扩增仪购自美国ABI公司，GeneGenius凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司，Mx4000荧光PCR仪购自美国Stratagene公司。1.4引物及探针设计在GeneBank上检索登革病毒4个血清型中都一致的高度保守序列，根据登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列，设计登革1～4型RT-PCR通用引物，扩增片段长度为511bp。根据DEN3端非

8、编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和Taqman探针，探针5′用FAM报告荧光基团标记，3′用MGB淬灭荧光基团标记，扩增片段长度为68bp。登革病毒RT-PCR通用引物：Den-D1：5′TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG　3′Den-D2：5′TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC　3′