实时荧光定量rt-pcr实验流程

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1、实时荧光定量反转录PCRReal-TimeReverseTranscriptionPCR（RT-PCR）1材料1.1仪器756型紫外分光光度计国产上海ABI7300Real-TimePCRSystem美国ABI公司RS-28高速低温离心机德国贺利氏公司超低温冰箱德国贺利氏公司UVP凝胶扫描系统美国UVP公司微量移液器德国Gilson公司DYZ-22A型双恒定时电泳仪北京市六一仪器厂DYY-Ⅲ桥式电泳仪北京市六一仪器厂1.2试剂RNA提取试剂TrizolReagent为Invitrogen公司产品；逆转录酶（M-MLV），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，TaqDNA聚合酶（T

2、aqDNApolymerase），随机引物（Randomprimers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega公司产品；荧光定量试剂盒：HotStartFluorescentPCRCoreReagentKits(SYBRGreenI),BBI公司RNA提取:取约100mg组织于冰浴匀浆器中，加入1mlTrizol(Invitrogen,USA)，迅速研磨成匀浆液，加入200ml氯仿，震荡30S，冰上放置5min。4℃，12000rpm，离心10min，取上层水相转移至另一1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置2h。然后4℃，12000rpm，离心20m

3、in，弃上清，加入1ml75%乙醇，轻轻混匀，4℃，12000rpm，离心10min，吸净上清液，于室温下晾干，加入20mlDEPC处理的去离子水溶解沉淀，-80℃保存备用。反转录（RT）:（试剂盒:Promega，USA）反转录反应液组成如下表：Table1MixedcomponentsforsynthesisofcDNAfirstchainComponentVolume（ml）Concentration5×R.T.buffer*51×dNTP2.510mM/mlRNasin220U/mlRNA5.38mgRandomPrimer10.1ug/mlM-MLV65U/mlNucleas

4、r-FreeWater3.2Total2542℃反转录50min，95℃5min灭活反转录酶。SyberGreen荧光定量PCR检测：(HotStartFluorescentPCRCoreReagentKits(SYBRGreenI),BBI)仪器型号：ABI7300Real-TimePCRSystem,美国ABI公司PCR反应液组成如下表：Table2MixedcomponentsforpolymerasechainreactionComponentVolume（ul）R.T.product12×MasterMix10Primer1+1H2O7Total20PCR热循环参数：96℃4

5、min，然后三步反应：94℃30S，58℃30s，72℃30s，进行40个循环，于每个循环的第三步即：72℃30s收集荧光信号。实时荧光定量PCR结果分析:扩增完毕后，进入结果分析界面，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。引物序列：GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’下游引物:3’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’