实时荧光定量pcr一般流程

《实时荧光定量pcr一般流程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、LUYangApplicationSpecialistGeneCompanyLtd实时荧光定量PCR一般流程内容实验目的实验方案实验关键实验试剂耗材实验目的实验方案实验关键实验试剂耗材未知样品中目的基因绝对量：绝对定量比较不同样品中目的基因相对表达量：相对定量检测未知样品基因型：SNP分析检测未知样品中某种成分的存在与否：存在/不存在分析………………实验应用目的不同实验应用，实验准备不同未知样品中目的基因绝对量标准品：已知确切浓度，分子结构和目的基因类似梯度稀释：至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围样品重复

2、：每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义标准曲线：斜率和标准差必须要符合数学意义不同实验应用，实验准备不同比较不同样品中目的基因相对表达量内参基因：用于数据均一化扩增效率比较：比较内参基因和目的基因的扩增效率，以确定相对定量的不同定量模式△Slope>0.1，使用相对标准曲线法△Slope<0.1，可以使用比较CT值法不同实验应用，实验准备不同比较不同样品中目的基因相对表达量△Slope>0.1，使用相对标准曲线法标准品：内参基因和目的基因，不需知道样品确切浓度浓度梯度：至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围

3、样品重复：每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义标准曲线：斜率和标准差必须要符合数学意义不同实验应用，实验准备不同比较不同样品中目的基因相对表达量△Slope<0.1，使用比较CT值法内参基因：数据均一化数学公式：2－△△CT不同实验应用，实验准备不同检测未知样品基因型荧光探针：两种不同标记，不用两种不同基因型检测不同荧光表明基因型的不同不同实验应用，实验准备不同检测未知样品中某种成分的存在与否IPC：阳性对照，检验反应体系工作与否目的基因探针：荧光信号有无判断存在与否实验目的实验方案实验关键实验试剂耗材实验应用方案：基本流程目

4、的基因（DNA和mRNA）的查找和比对GeneBank或者文献查找实验应用方案引物和探针设计遵循引物设计的一般规则，特别是多重反应的应用根据自身情况确定荧光探针的种类遵循所选探针设计的一般规则BLAST比对确认引物特异性实验应用方案荧光报告基因的选择根据自身仪器的性能根据自身实验条件尽可能选择相对成熟的荧光报告基团：FAM，VIC等选择高品质引物探针合成商实验应用方案标准品制备（标准曲线法）新鲜标准品遵循所有标准品制备原则实验应用方案退火温度热启动引物浓度引物和探针的纯度镁离子浓度模板质量模板浓度UNG处理实验应用方案PCR反应

5、体系优化通常以3－15循环的荧光值作为阈值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线具体实验可以调整实验应用方案基线和阈值调节软件给出标准曲线和未知样品中起始模板的量：绝对定量通过得到的CT，套用现成公式进行定量：相对定量根据软件荧光图谱，判断基因型或者存在/不存在实验应用方案数据分析退火温度热启动引物浓度引物和探针的纯度镁离子浓度模板质量模板浓度UNG处理实验应用方案PCR反应体系优化退火温度热启动引物浓度引物和探针的纯度镁离子浓度模板质量模板浓度UNG处理实验应用方案PCR反应体系优化实验目的实验方案实验关键实验试剂耗材实验应

6、用关键标准品制备和标准曲线制作重复样品PCR反应体系的优化荧光基团的正确选择实验目的实验方案实验关键实验试剂耗材实验应用试剂耗材根据自己应用目的选择相应的试剂选择高质量的试剂耗材供应商使用配套的试剂盒使用正确的耗材和试剂：StepOne为0.1ml光学反应管Thankyou!