鸡TGF-131mRNA荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、中国兽医杂志2013年(第49卷)第12期33鸡TGF—p1mRNA荧光定量PCR检测方法的建立胡丽君，郑艳生，高雪丽，郑世民，刘超男，吕晓萍(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030)中图分类号：$858．31文献标识码：B文章编号：0529—6005(2013)12—0033—03TGF-~超家族(transforminggrowthfactor-[3super-尔滨某孵化场。经鸡马立克病、鸡传染性囊病、鸡family)是由许多生物学特性相同的信号分子组成的传染性喉气管炎和鸡新城疫等疫病抗体检测，结大家族u，至少有6个结构相关的亚型，即TGF—Bl、果均呈阴性。

2、大肠杆菌DH5eL感受态细胞，2、3、4、5、6。哺乳动物中只发现TGF—I31、TGF—B2、pMD18一T载体购自宝生物T程(大连)有限公司。TGF一[33三种，其序列同源达60％~80％，鸡和两栖1．2主要试剂和仪器PLatinum~SYBR~Green类还有TGF一[34、TGF—p5。研究表明，鸡的TGF～p4qPCRSuperMix—UDG及TRIzol，购自美国Invitrogen就是TGF—Bl，两者是同一物质嘲。TGF一[31是一种具公司；Oligo(dT)15，购自北京天根生化科技有限公司；有多生物功能的细胞因子，在细胞增殖分化、组织损M—MULV，购自P

3、romega公司；AxyPrepDNA凝胶回收伤修复、问质形成、骨再生等方面起关键作用，因此，试剂盒，购自爱思进生化技术(杭州)有限公司；在器官纤维化、器官移植、肿瘤、癌症等疾病中被广StarPrepPLasmidMiniprepkit，购自北京康润诚业生泛研究。实时荧光定量PCR(Real—timefluorescence物科技有限公司；RibonueLeaseInhibitor、rTaq、dNTPquantitativePCR，RT—FQ—PCR)技术可从mRNA水平Mixture、DNAMarker2000，均购自宝生物工程(大连)检测细胞因子的表达，其中SYBRGre

4、en染料法因具有限公司。LightCycLer2．0荧光定量PCR仪(美国有高灵敏、少污染、可定量等优点而被广泛应用。据Roche公司)；GDS一800凝胶成像系统(美国UVP公此，本试验旨在建立一种检测鸡外周血及免疫器官司)；PTC一200PCR仪(美国BIO—RAD公司)。TGF—B1的SYBRGreenRealTime—PCR方法，为相关1-3引物的设计及合成根据GenBank上，用研究提供有效的技术支持。Primer5．0软件设计引物TGF—p1和p—actin，基因1材料与方法引物序列和扩增片段长度见表1。引物由宝生物1．1试验动物、菌种和质粒海蓝白雏鸡购自哈工程f

5、大连)有限公司合成。表1引物序列及其扩增片段1-4总RNA提取及cDNA的合成无菌采取新鲜抗提取总RNA，溶于20LDEPC水中，1．5％琼脂糖凝凝血，用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法(1700胶电泳后观察，并于紫外分光光度仪下测定ODOD。r／min离心15min)分离淋巴细胞(免疫器官不需提取并计算其比值，鉴定RNA样品质量。反转录体系及淋巴细胞，可直接提取总RNA)，按照TRIzol试剂盒条件按反转录酶说明书进行操作，所得反应液用于收稿日期：2012—11—16常规PCR和Real—timePCR，或一2O。c保存备用。基金项目：国家自然科学基金青年科学基金(30901

6、062)；东北农业大1．5目的片段扩增反应体系为：lOxBuffer5L，学科学研究基金作者简介：胡丽君(1987一)，女，博士生，研究方向为畜禽免疫病理，dNTPMixture(2．5mmol／L)8I,zL，rTaq0．25L，cDNAE—mail：ljhulO11@163toni通讯作者：高雪丽，E—mail：ga0xuelidn@yaho0．con1．cn6L，上下游引物(10mol／L)各2L，ddH：O补36巾同兽医杂志2013年(第49卷)第12期ChineseJournalofVeterinaryMedicine科学技术出版社，2004：90—99．[8]Ca

7、rstenBSchmidt—Weber，KurtBlaser．RegulationandroleofGressnerAM，WeiskirchenR．Modempathogeneticconceptsoflivertransforminggrowthfactor—BinimmunetoleranceinductionandfibrosissuggeststellateceilsandTGF—betaasmajorplayersandinflammation[J]．CurrentOpinioninhnmun