Roche荧光定量PCR 相对定量建立方法.pdf

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1、相对定量——如何呈现完美的实验结果目录序言1样本材料和核酸分离6逆转录10测定方法设计12管家基因13扩增效率15序言序言基因表达的过程是：通过一个基因的遗传信息最终编码产生一种功能基因产物，例如RNA和蛋白质。因此基因表达的调控决定了细胞结构和功能并且作为细胞分化、形态形成以及适应外部诱因的基础。基因表达过程中有几个步骤可供调控，包括转录、翻译和翻译后修饰。实时定量PCR是一种方法，用以测定第一步基因表达中的变化。因此在下文中，术语“基因表达”仅被用于该步骤并且不包含其它基因表达步骤。在大多数定量实验室研究中，并不需要或者在很多情况下不能获得研究样本基因拷贝数的绝对值。

2、多种传统技术（例如RNA印迹法）可分析未知样本中的目标基因表达量相对于另一种基因转录，即内参基因表达量的比值。实时PCR中可得出相同的概念：相对于非调控参考计算每种样本的目标浓度并且将结果表达为目标基因/内参基因表达量的比率。定义内参基因，又被称为内源性质控品，是组成型表达基因或者管家基因，在所有的测试条件下这种基因都具有恒定的拷贝数量，并且提供一个标准，因此在相同研究条件下基因的表达水平可被标准化。相对定量测定常用于那些需要比较多种样本变化的应用中，纵使这些样本发生定性或定量改变。基因表达研究通常试着测定一段时间后，相对于已测定的起始点（例如无病状态或未治疗状态。），目

3、标基因改变其表达特征的方式（例如疾病或治疗过程中基因表达发生了多少变化），由于相对定量测定允许研究者在至少两种条件下简单比较目标基因的表达水平（例如无病/疾病状态或未治疗/治疗状态），相对定量方法是测定基因表达的理想方法。本方法使用了一种内源性质控品作为参考，这种方法具有纠正可影响PCR的因素的优势。初始样本量的变化核酸回收率的变化样本材料可能的RNA降解样本和/或核酸性质的不同样本加载/吸样误差的变化cDNA合成效率的变化1序言通过目标RNA的浓度除以相同样本中参考RNA的浓度纠正样本定性和定量的差值（图1）。concentrationoftargetrelativer

4、atio=concentrationofreference图1：相对定量的结果是一个相对比值，是一个不带单位的裸数。图2显示经过不同处理的细胞培养的示例（TC1和TC2）。由于样本变化太大，仅凭绝对目标浓度（T）的计算结果明显不足以评估目标基因的表达。评估结果必须以稳定的所谓内参基因（R）为基础。结果是一个相对比值，一个不带任何单位的裸数。在我们的示例中，你可以看到与目标细胞2相比目标细胞1中的表达增加了十倍。T=10T=10=2=0.2R=5R=50TC1TC2增加了10倍图2：Changesinexpressionoftwodifferentlytreatedcell

5、cultures.2序言比较不同样本的表达水平最常见的方式是指定其中一个样本作为所谓的校准品。定义校准品是一个具有稳定的目标基因表达和内源性内参基因表达之比，被用于标准化不同样本的基因表达结果。随后，所有其它样本都与该校准品进行比较。为了标准化最终的结果，将每种样本的目标基因/内参基因比除以校准品样本的目标基因/内参基因比（图3）。校准品的标准化值为1。concentrationoftargetconcentrationofreference(sample)calibrator=normalizedratioconcentrationoftarget(calibrator

6、)concentrationofreference图3：根据一个校准品样本标准化基因表达结果该校准品——通常为阳性质控样本——可能是诸如分离自特定细胞株或组织的RNA。其它典型校准品样本示例为：未经处理的细胞株“零”时间点的样本正常组织在提到的示例中，有必要定义一种未经处理的细胞培养（UTC）作为校准品（图4A）。经过处理的细胞培养物1中的目标基因与未经处理的细胞培养物中的表达量相等，得出比值为1，然而经过处理的细胞培养物2中的目标基因表达减少了10倍，得出0.1的结果（图4B）。AT=100T=10T=10=2=2=0.2R=50R=5R=50UTC=calibrato

7、rTC1TC2lasequsle10-fold图4：Changesofgeneexpressionoftwodifferentlytreatedcellculturesagainstacalibratorsample.3序言B1.00E31.00E21.00E11.00E0Ratio1.00E·11.00E·21.00E·3WithoutcalibratornormalizationAftercalibratornormalization图4：Graphicalrepresentationofchangesingeneexpr