鸭黄病毒荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、第52卷第23期湖北农业科学V01．52No-232013年12月HubeiAculturalSciencesDee．，2013鸭黄病毒荧光定量PCR检测方法的建立张蓉蓉，温国元，罗青平，王红琳，邵华斌(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所／动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉430064)摘要：根据鸭黄病毒HBJL株NS5基因序列设计合成了引物和探针．通过对荧光定量PCR反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量PCR检测鸭黄病毒的方法结果表明，该方法具有很好的特异性和重复性，荧光定量PCR敏感性是常规PCR的100倍左右同时对

2、30枚人工接种的鸭胚进行检测并与常规PCR方法进行比较．检测结果也表明荧光定量PCR法比常规PCR的敏感性高关键词：鸭黄病毒：TaqMan探针：荧光定量PCR中图分类号：$852．65．6文献标识码：A文章编号：0439—8114(2013)23—5811-03EstablishmentofFluorescenceQuantitativeRT-PCRAssayforDetectingDuckFlavivirusZHANGRong-rong，WENGuo-yuan，LUOQing-ping，WANGHong—lin，SHAOHua—b

3、in(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary，HubeiAcademyofAculturalScience／HubeiKeyLaboratoryofAnimalEmbryoEngineeringandMolecularBreeding，Wuhan430064，China)Abstract：ATaqMan—basedreal—timeRT—PCRassaywasdevelopedfordetectingduckflavivirus．Theprimersandprobesweredesigneda

4、ndsynthesizedbasedonthesequencesofNS5geneofduckflavivirusHBJL．Thereactionconditionswereoptimized．Theesta}：lishedreal—timePCRwerecomparedwithroutinePCR．Theresultsshowedthattheestablishedreal—timePCRassaywashighlyspecificandreproducible，100-foldmoresensitivethanthegel—ba

5、sedPCRondetectingtheduckfla-vivirusinfectedducks．30samplesofartificialinfectedduckembryosweredetectedbygel—basedPCRandreal—timePCRandtheresuhsshowedthatitssensitivitywashigherthanthatoftheroutineRT—PCR．Keywords：duckflavivirus；TaqManprobe；fluorescencequantitativePCR2010

6、年以来，中国上海、浙江、江苏等地出现了1材料与方法蛋鸭产蛋量严重下降及蛋鸭死亡现象同年在湖北省一些养鸭场也出现不明原因引起的产蛋量下降1．1材料现象．临床表现为产蛋量严重下降甚至停止．且蛋鸭黄病毒HBJL株为动物胚胎工程及分子育种鸭有一定的死亡率．剖检病死鸭脾脏呈现明显肿湖北省重点实验室保存．该毒株用8～12日龄的鸭胚大，卵巢肉变，卯泡严重充血，出血⋯。增殖临床诊断为鸭黄病毒感染引起的病毒病感染．1．2主要试剂该病的发生给养殖户带来了巨大的经济损失为了TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制提高鸭黄病毒检测的准确性和高效性．

7、本研究拟建剂、DEPC、dNTPs、Mg+均购自宝生物工程(大连)有立一种能用于该病检测的一步法荧光定量PCR方限公司：TransDNAMarker111购于北京全式金生法，为鸭黄病毒的流行病学、致病机理及诊断与防物科技有限公司：ViralRNAMiniKit(50)购自上治等方面提供技术平台海华舜生物技术有限公司收稿日期：2013一l1一O5基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项(201003012)；湖北省农业科技创新中心项目(2011—620—001—0O3)；动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题(2010ZD15

8、0)作者简介：~(1980一)，女，湖北荆州人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病研究，(电话)027—87380193(电子信箱)zhangfqw@163．corn；通讯作者，邵华斌，研究员，(电子信箱)shhb1961@163．