荧光定量PCR手册.pdf

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1、实时荧光定量PCR手册单管Assay96或384孔板384孔TaqMan®ArrayCardOpenArray®芯片上图显示的为实时荧光定量PCR常用的产品形式。实时荧光定量PCR基础知识1实验设计2反应板制备3数据分析4疑难解析5数字PCR6实时荧光定量PCR基础知识1实时荧光定量PCR基础知识1.1简介21.2实时荧光定量PCR概述31.3实时荧光定量PCR组分概述411.4实时荧光定量PCR分析61.5实时荧光定量PCR荧光检测系统101.6熔解曲线分析141.7参比荧光染料151.8污染预防161.9多重实时荧光定量P

2、CR161.10内部质控品和参考基因181.11实时荧光定量PCR仪校准19lifetechnologies.com1实时荧光定量PCR基础知识1.1简介聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域功能最强大的技利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器，检测反术之一。采用PCR技术，利用序列特异性寡核苷酸、热应过程中荧光的变化。实时荧光定量PCR仪通过绘制荧稳定性DNA聚合酶和热循环，可将DNA或cDNA模板内光与循环数曲线，生成扩增曲线，表示在整个PCR反应的特异性序列拷贝或“扩增”数千至数百万倍。在传统(终过程中积聚的产物(

3、图1)。点)PCR中，扩增序列的检测和定量是在反应结束，即实时荧光定量PCR的优点包括：最后一次PCR循环完成后进行的，且需要PCR后分析，如凝胶电泳和图像分析。在实时荧光定量PCR(qPCR)中，•能够实时监控PCR反应的进程每次循环均检测PCR产物。通过监测指数扩增期的反应，•能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从1用户可以确定靶点的起始量，且精度极高。而对样本中的起始材料量进行准确定量•具有更大的检测动态范围在理论上，PCR可呈指数型扩增DNA，使每个扩增循环•在单管中实现扩增和检测，无需PCR后处理中的靶分子数倍增。在

4、PCR问世之初，科学家推断，通过与已知标准品进行比较，利用循环数和PCR终产物的在过去的数年中，实时荧光定量PCR已成为DNA或RNA量可以计算出遗传物质的起始量。为达到可靠定量的要检测和定量的主要工具。采用上述技术，您可以实现精确求，实时荧光定量PCR技术得以问世。如今终点PCR主的检测，其准确度低至2倍范围，起始材料的动态范围达要用于扩增特定的DNA，用于测序、克隆及其它分子生物6至8个数量级。学技术。在实时荧光定量PCR中，每次循环结束后通过荧光染料检测DNA的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段)

5、数直接成正比。利用反应指数期采集的数据，生成有关扩增靶点起始量的定量信息。实时荧光定量PCR使用的荧光报告基团包括双链DNA(dsDNA)结合染料或在扩增过程中掺入PCR产物的、与PCR引物或探针结合的染料分子。起始靶点相对荧光基线荧光荧光阈值循环数图1.相对荧光与循环数。通过绘制每个样本的荧光信号与循环数曲线，生成扩增曲线；因此，扩增曲线表示在实时荧光定量PCR实验过程中积聚的产物。用于创建本图曲线的样本是连续梯度稀释的DNA靶序列。2实时荧光定量PCR基础知识1.2实时荧光定量PCR概述本部分将概括实时荧光定量PCR的步骤

6、。实时荧光定量两步法qRT-PCRPCR是在标准PCR技术基础上演变而成，常用于定量样两步法定量逆转录PCR(qRT-PCR)的第一步是采用逆转录本中的DNA或RNA。利用序列特异性引物，可测定特定酶(RT)将总RNA或poly(A)RNA逆转录为cDNA。采用的DNA或RNA序列的拷贝数。通过检测PCR循环的每随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物(GSP)完成第一链个阶段中扩增产物的量，实现定量。如果样本中存在高丰cDNA合成反应。为在实时荧光定量PCR应用中平均表示度的特定序列(DNA或RNA)，则在早期循环中即可

7、观察到所有靶点并避免oligo(dT)引物的3’偏差，许多研究人员扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。采用了随机引物或oligo(dT)和随机引物的混合物。利用荧光探针或荧光DNA结合染料，采用实时荧光定量cDNA合成采用的温度取决于所选的RT酶。逆转录完成PCR仪检测荧光并完成PCR反应所需的热循环，实现扩1后，将约10%的cDNA转移至单独的管中，完成实时荧光增产物的定量。定量PCR反应。实时荧光定量PCR的步骤一步法qRT-PCR实时荧光定量PCR反应的每个循环包括三个主要步骤。一步法qRT-PCR可在同一

8、管内完成第一链cDNA合成反一般运行40个循环。应和实时荧光定量PCR反应，简化了反应设置，并降低1.变性：利用高温孵育将双链DNA“熔解”为单链，并了污染的可能性。需要使用基因特异性引物(GSP)。这是松开单链DNA的二级结构。一般采用DNA聚合酶可由于在一步法操作中使用o