鼻气管鸟杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、第36卷第2期中国预防兽医学报Vo1．36．No．22014年2月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineFeb．2014doi：10．3969~．issn．1008-0589．2014．02．09鼻气管鸟杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立李富祥，段志华，赵文华，信爱国，杨仕标，李华春(1．云南省畜牧兽医科学院，云南昆明650224；2保山市动物疾病预防控制中心，云南保山678000)摘要：为建立鼻气管鸟杆菌(ORT)TaqMan荧光定量PCR检测方法，本研究根据ORT16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，通

2、过优化反应条件、特异性、敏感性、重复性试验和临床样品的检测，建立了ORTTaqMan荧光定量PCR检测方法。实验结果表明：该方法具有良好特异性；最低可以检测到1．09x10拷贝／“L的标准品阳性质粒；批内和批间变异系数均小于3％；23份临床样品检测的阳性率为48％。该方法可以用于鸡ORT感染的早期诊断及ORT的快速鉴定和定量分析。关键词：鼻气管鸟杆菌；TaqMan荧光定量PCR；16SrRNA基因中图分类号：$852．61文献标识码：A文章编号：1008．0589(2014)02．0121．04DevelopmentofTaqManreal—timePCRassayfordetection

3、oftheOmithobactelIlumrhinotrachealeLIFu-xiang，DUANZhi-hua，ZHAOWen—hua，XINAi-guo，YANGShi—biao，LIHua—chun’(1．YunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute，Kunming650224，China；2．BaoshanCenterforDiseaseControlandPrevention，Baoshan678000，China)Abstract：Toestablisharapidandhighthrough-putmethodforOmithobact

4、eriumrhinotrachealedetection，aTaqManreal-timePCRassaywasdevelopedforthebacteriadetectionwithapairofprimersandoneTaqManprobedesignedaccordingtothesequenceofthel6SrRNAgeneofO．rhinotracheale，whichwasamplifiedbyPCRandclonedintopMD19-TtoconstructstandardrecombinantplasmidofpMD-16S．Undertheoptimizedreac

5、tionconditions，thetestresultsshowedthatthismethodwasspecificfordetectingO．rhinotrachealewithadetectionlimitof1．09xl0。copies／IxL，andhadnocross—amplificationsforotherchickenbacteria，includingE．coli，Salmonella，Streptococcus，Staphylococcus，R．anaapestifer，Enterococcus，H．paragallinarum，P．mirabilisandG．a

6、natis．Therepeatabilitytestsindicatedthattheinter-andintra-variationwerelessthan3％．Therefore．thedetectionmethodcouldbeappliedinearlydiagnosisofO．rhinotrachealeinfections，rapididentificationandquantitativeassayofthebacteria．Keywords：Omithobacteriumrhinotracheale；TaqManreal-timePCR；16SrRNAgene鼻气管鸟杆菌(

7、Omithobacteriumrhinotracheale，增高，产蛋鸡的产蛋量减少。各种家禽和野禽对ORT)感染是禽类的一种接触性传染疾病，其临床症ORT均易感，该病呈世界分布[1_2]。近年来，我国的状主要表现为流鼻液、呼吸紊乱、死亡率和淘汰率多地报道了ORT感染，本研究室也于2011年在*Correspondingauthor收稿日期：2013．05．02基金项目：云南省农业科技创新工程(2008LA019)；云南