牛白血病前病毒Taqman荧光PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、·12·《上海畜牧兽医通讯》2014年第1期牛白血病前病毒Taqman荧光PCR检测方法的建立李凯航鞠厚斌杨显超宁昆王建(上海市动物疫病预防控制中心上海201103)【摘要】设计并合成荧光引物，建立了Taqman荧光PCR体系，可快速检测全血样品中的牛白血病前病毒DNA。所建立的荧光PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸，而对牛病毒性腹泻一粘膜病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)以及羊胎肾细胞(FLK)、牛布鲁氏菌扩增均呈阴性反应，对pBST—pol重组质粒的检测敏感性可达0．32拷贝。重复性实验的Ct值变异系数介于0．67～1．16之间，稳定性实

2、验的Ct值变异系数为3．14。采用建立的Taqman荧光PCR体系和OIE推荐的套式PCR对94份临床样品进行检测，两者定性符合率达到97．87。关键词：牛白血病前病毒；Taqman荧光PCR；引物地方流行性牛白血病是由牛白血病病毒1．4阳性对照质粒的构建(BLV)引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征BLV的pol基因由PCR扩增获得，通过TA克为淋巴样细胞恶性增生，进行性恶病质和发病后的隆得到pBST—pol重组质粒并经序列证实，确定为高死亡率。此病在19世纪末被发现，但到1969该基因阳性质粒后，用紫外分光光度计A26O／A28O年才由美国的Miller从

3、病牛外周血液淋巴细胞中吸光值测定质粒浓度，一30℃保存备用。pBST质分离到。目前此病遍及全世界，我国7O年代在安粒购自Novagen公司，胶回收试剂盒购自TAKA—徽发现首例后，继而在各省市发生。近年，我国牛RA。群该病血清阳性率已从4％升高至3O1．5荧光PCR反应体系的建立～60“。荧光PCR试验在ABI7500荧光PCR仪上进目前对于牛群内BLV感染的普查通常基于血行，对引物浓度、dNTP浓度、探针浓度和热启动清学试验如ELISA，可以很好地估计BLV在牛群Taq酶浓度等反应条件进行了优化。dNTPs、Taq内的流行情况。但样品仅依靠血清学检测并不酶等

4、均购自TAKARA公司，引物和探针由invitro—够，Martin等报道同样一批可疑样品，间接gen公司合成。ELISA的检出率为10，而依靠PCR方法的检出1．6特异性、敏感性和重复性试验率可达到17。对于大量样品BLV的检测，有必将牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病要建立特异性强、灵敏度高的PCR检测方法，这有毒、牛布鲁氏菌、羊胎肾细胞(FLK)作为4个对照样利于针对牛白血病流行病学感染情况彻底进行本提取核酸，各取2作为模板进行PCR扩增，同调查。时设蒸馏水为阴性对照组。1材料和方法将计数后的pBST—pol质粒进行1O倍梯度稀1．1病毒与临床样品释，

5、阳性质粒(3．2×10copies／mL)按1：10～1：牛病毒性腹泻一粘膜病毒(BVDV，种毒10进行相同的3组稀释，从每个梯度中各取3p．LAV69)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV，种毒模板进行荧光PCR检测。AV20)、羊胎肾细胞(FIK)购自中国兽医药品监察以相同稀释度的阳性质粒作为模板，并以10倍所，牛布鲁氏菌样本为牛布病II型活疫苗，血清学梯度稀释成3个不同梯度的模板(1：10，1：10，阳性牛的EDTA抗凝血样品由本中心采集保存。1：10。)，重复10次反应。1．2核酸提取1．7荧光PCR与套式PCR的比对样品的核酸提取采用AXYGEN公司Ax

6、yPrep1．7．1样本的前处理：无菌尾根采集上海市1O个体液病毒DNA／RNA小量试剂盒(CatNo．规模化奶牛场临床疑似牛EDTA抗凝血样本共9451304)，一20℃保存备用。份，4℃冰箱待检。样本核酸提取参考AXYGEN1．3引物的设计公司AxyPrep体液病毒DNA／RNA小量试剂盒说采用AB公司Primer5．0软件，根据BLVpol明书。基因序列设计的特异性引物和荧光探针序列如下：1．7．2套式PCR检测：参考OIE推荐的套式PCR上游引物C1：5，_AACCCCACCTTCCCATGAC一引物序列合成，PCR结束后克隆取阳性重组质粒进3’；下游

7、引物C2：5，_TGGTAGGAGGTTAATCT—行序列测定，最后将采集的94份全血样品同时进行GATTGTGAGT一3’。FAM-CAGGCCCTTTCTC—荧光PCR方法检测，将结果进行对比。GAGCCCTCTG—TAMRA引物由Invitrogen公司2结果合成并标记荧光基团，扩增全长71bp。2．1建立了3OuL荧光PCR反应体系：上、下游