taqman荧光定量rt-pcr检测猪脂蛋白酯酶mrna方法的建立

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1、5期廉红霞等：TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立5TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪脂蛋白酯酶mRNA方法的建立廉红霞1,3，卢德勋2，高民2（1内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特010018；2内蒙古农牧业科学院，呼和浩特010030；3河南农业大学牧医工程学院，郑州450002）摘要：【目的】克隆猪cDNA，作为猪LPLmRNA定量检测的标准品，建立检测方法。【方法】用RT-PCR，从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA，将纯化的LPLcDNA与pGM-T载体进行连接

2、,转化宿主菌TOP10，提取重组质粒DNA，PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPLmRNA实时定量PCR检测方法，特异性好，检测灵敏度达103拷贝，线性范围为1×103～1×1010拷贝，阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2＝0.9871）。【结论】成功克隆了LPL实时荧光PCR定量标准，且TaqMan荧光定量RT-PCR的方法可对猪背最长肌LPLmRNA的表

3、达进行准确定量。关键词：猪；脂蛋白酯酶；实时定量RT-PCR；TaqMan荧光探针EstablishmentofReal-timeTaqMan-FluorescenceQuantitativeRT-PCRAssayforDetectionandQuantificationofPorcineLipoproteinLipasemRNALIANHong-xia1,3,LUDe-xun2,GAOMin2(1CollegeofAnimalScienceandAnimalMedicine,InnerMongoliaAgricultural

4、University,Huhhot010018;2InnerMongolianAcademyofAgriculturalandAnimalScience,Huhhot010030;3CollegeofAnimalScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002)Abstract:【Objective】PorcineLPLcDNAwasclonedasthestandardforreal-timequantifyingLPLmRNAandtheTaqManfluorescen

5、cequantitativePCRassayfordetectionwasestablished.【Method】TotalRNAextractedfromlongissimusdorsiofporcinewasreversetranscribedtocDNA.LPLcDNAwasligatedwithpGM-TvectorandtransformedintobacteriumTOP10.PlasmidDNAextractedfrompositivecloneswasverifiedbyPCRamplificationands

6、equenced.LPLwasamplifiedbyreal-timefluorescencequantitativePCRfromtheplasmidDNA.TheconcentrationofDNAtemplatepurifiedwasdetectedbyanalysingabsorbancein260nmandthenthecombinedplasmidwasdilutedtoseriesasstandardforFQ-PCR.【Result】ThemethodofLPLmRNAreal-timePCRwaswelles

7、tablished,whichdetectedaslowas103copieswiththelinearrangefrom103to1010copies.Thestandardcurvesshowedhighcorrelations(R2=0.9871).【Conclusion】Aseriesofstandardsforreal-timePCRanalysishavebeenconstructedsuccessfully,andreal-timeTaqMan-FluorescenceQuantitativeRT-PCRisre

8、liabletoquantitativelyevaluateFQ-PCRmRNAinlongissimusdorsiofporcine.Keywords:Porcine;Lipoproteinlipase;FQ-PCR;TaqManfluorogenicprobe5期廉红霞等