鸡新城疫荧光PCR检测方法的建立及应用

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1、Y7291{5关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：哲导师签名：

2、茸劢榍日期：丛．莎些奎奎、业盔堂翌圭望塞生兰垒笙奎!垫!!!AmpbDgugngpgmLULUhmlnSeCDNARNAPCRRT-PCRRTF—PCREBIPTGLBTaqdATPdUTPdCTP中英文缩略表Ampicillinbasepairsgrammicrogramnanometerpicrogram1itermillilitermicroliterHnithourminutesecondDeoxyribonucleicacidRibonucluncacidPolymerasechainreactionreverstranscripti

3、onReal-timeflurescentPCREthiditimbromideIsopropylthio——B—。D—·galactosideLuria—BertanimeditimThermusaquaticuDeoxyadenosinetriphosphateDeoxyuridinetriphosphateDeoxycytidinetriphosphatel氨苄青霉索碱基对克微克纳克皮克升毫升微升单位小时分钟秒脱氧核糖核酸核糖核酸聚合酶链式反应反转录PCR实时荧光PCR溴化乙锭异丙醇一B—D一硫代半乳糖LB培养基水生热栖酶脱氧腺苷三磷酸脱

4、氧尿苷三磷酸脱氧胞苷三磷酸鸡新城疫实时荧光P啄检测方法的建立及应用dGTPdTTPX—GalM叫LvRnasinMCtAIVILTVIBVMGNDVrpmHAHIDeoxyuridinetriphosphateDeoxythymidinetriphosphate5-Bromo—-4-Chloro—’3—-Indolyl一§一D-GalactosideM—MLVReverseTranscriDtasePmasinRibonucleaseInhibitorm01／literC：cycle：t：threshouldAvianInfluenzaviru

5、sInfectiousLaryngotracheitisvirusInfectiousBronchitisvirusMycoplasmGallinarumNeweastleDiseaseⅥrusratationperminuteHemagglutinationinhibition2脱氧鸟苷三磷酸脱氧胸腺苷三磷酸5--溴一4氯一3吲哚～B—D一半乳糖M-ML、f逆转录酶核糖核酸酶抑制剂摩尔／升每个反应管内的荧光信号达到设定阀值时所经历的循环数禽流感病毒传染性喉气管炎病毒传染性支气管病毒鸡支原体鸡新城疫病毒每分钟转数血细胞凝集反应血细胞凝集抑制反应

6、山东农业大学硕士研究生学位论文(2005)鸡新城疫实时荧光PCR检测方法的建立及应用摘要鸡新城疫是由鸡新城疫病毒引起的急性、高度接触性、烈性传染病，对养禽业危害极大。NDV传统的确诊方法主要依赖病毒的分离鉴定及血清学检测(主要包括鸡胚中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等方法)，这些方法耗时长、灵敏度低且经验依赖性强。PCR是一种快速准确的检测方法，但产物需经琼脂糖凝胶电泳和溴化已锭fEB，致癌物)染色等，易产生污染和假阳性。现代化生产需要建立一种快速、准确、高效的检测方法。实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术，在临床诊断中已经用于细

7、菌、病毒及遗传性疾病的检测，具有极大的应用价值。本研究根据荧光PCR检测原理，利用荧光双链引物建立了鸡新城疫病毒毒实时荧光PCR检测方法。本课题分为三个部分进行研究。第一部分鸡新城疫F蛋白基因的克隆根据GenbankNDVF糖蛋白mRNA全序列，设计了一对特异引物(Pl：5'-CTTGACACCTCATACTGT船一3’．P2：5’--CCCAAGCCATAATAAGGTCTT一3’)。提取NDV种毒RNA进行反转录，以反转录产物作为模板，利用上述一对引物进行PCR，结果只有以NDV种毒反转录产物为模板可以扩增出623bp的特异条带。紫光灯下切

8、割特异性条带并用v—gene试剂盒进行纯化。纯化产物与pMD18．TSimpleVector连接，连接产物转化感受态细胞JMl09，经蓝白斑筛选和PC