实时荧光定量pcr检测绵羊肉制品中鸡源性成分

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1、２０１６（１０上）：２８６－２８８，３００实时荧光定量ＰＣＲ检测绵羊肉制品中鸡源性成分１１２１李建平，李世新，高静，赵鲁（１．菏泽食品药品检验检测中心，山东菏泽２７４０００；２．菏泽市畜牧工作站，山东菏泽２７４０００）中图分类号：Ｓ８７９．２文献标识码：Ｂ文章编号：１００４－７０３４（２０１６）１０－０２８６－０４肉制品掺假已成为全球食品行业的一个突出问ＲｏｔｏｒｇｅｎｅＱ），均由德国ＱＩＡＧＥＮ公司生产；梯度题，不仅会引起个体的健康风险，包括疾病感染、代谢ＰＣＲ仪（型号为Ｔ１００），Ｂｉｏ－Ｒａｄ生产；微量核酸蛋紊乱、过敏反应等

2、，而且肉制品的掺假更易引起经济、白分析仪（型号为ＳＭＡ１０００），北京美林恒通科技有［１］宗教、道德的问题。对相关部门而言，建立快速有限公司生产。效的方法鉴定物种并对其进行监管十分必要。２方法以聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，２．１ＤＮＡ的提取及浓度、纯度的测定ＰＣＲ）技术为基础的种属检测技术已是食品中肉类成ＣＴＡＢ法提取肉类ＤＮＡ：取样品置于２ｍＬ离心［２－３］分鉴别的主流技术，且荧光定量ＰＣＲ技术的迅管中，加入ＣＴＡＢ、蛋白酶Ｋ，使用ＴｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒＬＴ进行速发展又将种属和外源基因鉴定技术

3、提高到了新层组织破碎（３０Ｈｚ，２ｍｉｎ），６５℃水浴３０ｍｉｎ，不时振［４－６］［７］次。李楠等研究了牛、羊生肉制品中鸭、鸡、猪荡混匀；加入５００μＬ氯仿－异戊醇（２４∶１）混合液强源性成分的荧光ＰＣＲ检测方法和使用ＰＣＲ扩增和烈振荡；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取上清液加入电泳检测的流程对肉制品中的鸡源性成分进行检测等体积异丙醇，强烈振荡后１２０００ｒ／ｍｉｎ离心的行业标准方法，然而具体的针对绵羊源性成分和鸡１０ｍｉｎ，弃上清液；用７５％乙醇洗涤２～３次，加ＴＥ源性成分检测方面，应用荧光定量ＰＣＲ技术并依托溶解ＤＮＡ

4、（ＴＥ量视ＤＮＡ沉淀多少而定，５０～全自动技术建立的快速、灵敏、准确地检测食品中绵１１０μＬ）。用微量核酸蛋白分析仪（型号为ＳＭＡ１０００）羊和鸡源性成分的定性、定量检测方法未见有报道。检测其纯度及浓度。试验结合相关研究和用于肉制品中鸡和羊源性２．２引物和探针序列成分鉴定的ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ引物与探针，建立所有引物和探针在上海生工生物工程技术服务了绵羊和鸡源性成分鉴定的荧光ＰＣＲ方法，以期为有限公司合成，引物和探针序列见表１。肉制品质量控制提供一种有效的途径。表１试验所用的引物和探针１材料１．１试验动物扩增长项目碱基序列度

5、／ｂｐ猪肉、绵羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、鸭肉、兔肉、驴正向引物５′－ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ－３′肉，市购。内参１３７反向引物５′－ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ－３′１．２仪器与试剂正向引物５′－ＡＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡＴＣＧＧＡ－３′ＴＭ荧光ＰＣＲ试剂ｐｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ，宝生物工程（大绵羊反向引物５′－ＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡ－３′１３６连）有限公司生产；２０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ，碧云天生物探针５′－ＨＥＸ－ＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＧＡＣＡＡＴＡＧＣ－ＴＡＭＲＡ－３

6、′技术公司生产。正向引物５′－ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴ－３′组织破碎器（型号为ＴｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒＬＴ）、ＰＣＲ分液鸡反向引物５′－ＧＴＣＡＴＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡ－３′６２仪（型号为ＱＩＡｇｉｌｉｔｙ）、毛细管凝电泳胶仪（型号为探针５′－ＦＡＭ－ＣＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＧＣＣＴＣ－ＴＡＭＲＡ－３′ＱＩＡｘｃｅｌａｄｖａｎｃｅｄ）、荧光定量ＰＣＲ扩增仪（型号为２．３ＰＣＲ和荧光定量ＰＣＲ反应ＰＣＲ反应体系（２０μＬ）：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２μＬ，收稿日期：２０１５－１２－０３；修回日期：２０１６－

7、０７－２０ｄＮＴＰ１．６μＬ，Ｔａｑ酶０．１μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ正反引物各作者简介：李建平（１９８１－），男，助理研究员，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖，ｊｐｌｉ２０００＠１６３．ｃｏｍ．１μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１３．３μＬ。反应条件：·２８６·№．１０，２０１６９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共３５个循环；７２℃再延伸５ｍｉｎ。荧光定量ＰＣＲ反应体系（２５μＬ）：２×ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１２．５μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ引物各１μＬ，探针１μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ（≤１０

8、０ｎｇ），ｄｄＨ２Ｏ８．５μＬ。每个体系设２个重复，取平均值。反应条件（鸡）：９５℃预变性３０ｓ；９５℃变性５ｓ，６０℃退火３０ｓ，收集荧光，共４０个循环。反应条件（绵羊）：９５℃预变性３０ｓ；９５℃变性５ｓ，５８℃退火３０ｓ，收集荧光，共４０个循