BJS 201904 食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法

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1、附件4食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法BJS2019041范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。本方法适用于肉及肉制品中猪（Susscrofa）、驴（Equusasinus）、山羊（Caprahircus）、绵羊（Ovisaries）、牦牛（Bosgrunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastorcoypus）、小鼠（Musmusculus）、大鼠（Rattusnorvegicus）、豚鼠（Caviaporcellus）和竹鼠（Rhizomyspruinosu

2、s）源性成分。2原理提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1检测用引物和探针(a)猪cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-

3、BHQ1-3’(b)驴nad5基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’(c)山羊cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’(d)绵羊cytb基因检测用引物探针序列为：15’端

4、引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’3’端引物：5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’探针：5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’(e)牦牛cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’3’端引物：5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’探针：5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’(f)鼠cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTCCACGAGAC

5、AGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’3’端引物：5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’探针：5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’3.2CTAB裂解液：2%(w/v)CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，备用。3.3蛋白酶K：20mg/mL，-20℃保存备用。3.4苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇（体积比25∶24∶1）。3.5异丙醇，优级纯。3.670%乙醇。3.7

6、实时荧光PCR预混液。以2×预混液为例，成分为：PCR缓冲液（终浓度1×），氯化镁（终浓度2.5mmol/L），dNTP（终浓度0.2mmol/L），TaqDNA聚合酶（终浓度1U）。3.8TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。4仪器和设备4.1组织研磨器。4.2核酸蛋白分析仪。4.3恒温水浴锅。4.4离心机（最大离心力≥12000g）。4.5微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL）。4.6实时荧光PCR仪。4.7涡旋振荡器

7、。4.8电子天平：感量0.01g。4.9高压灭菌锅。4.10pH计。5分析步骤25.1试样选取与制备多点采取肌肉组织，选取适量具有代表性的样品进行均质处理。所用器皿应为一次性耗材，或经过彻底清洗和高压消毒并单独使用。用过的器皿应采取措施消除核酸的污染，否则不可重复使用。5.2DNA提取称取解冻后的均质样品0.1g~0.2g，置于2mL离心管中，加入600μLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃孵育1h~2h，期间每隔10min振荡混匀；加入5