db22t 2079-2014 皮革中动物源性成分检测 实时荧光pcr 法

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1、ICS59.140.20B45备案号：42285-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2079—2014皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法Detectionofanimal-derivedingredientsinleatherbyrealtimePCRmethod2014-05-04发布2014-06-01实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2079—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国

2、延边出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘金华，聂丹丹，刘韬，王玮琳，刘阳，吴连鹏，王宁，罗雁菲。IDB22/T2079—2014皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法1范围本标准规定了天然皮革中动物源性成分的定性检测方法。本标准适用于天然皮革牛、羊、猪成分的定性PCR检测，不适用于再生革、人造革和合成革。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性

3、基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用CTAB裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR检测；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的扩增曲线判定，实现对皮革中牛、羊、猪源性成分的定性分析。4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB／T6682中二级水的要求。4.1十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)。4.2三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymet

4、hyl)aminomethane,Tris]。4.3三氯甲烷(chloroform)。4.4无水乙醇(absoluteethanol)。4.5异丙醇(isopropylalcohol)。4.675%乙醇溶液：取750mL无水乙醇，加水定容至1L。4.7乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）。4.8苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1,体积比）。4.92XReal-timePCR预混液。4.10Tris-HCl：在800mL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入60mL浓盐酸，冷却至室温后调节pH值至7.5，加水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20m

5、in。4.111.2mol/L氯化钠溶液4.12CTAB裂解液：2%CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA(pH8.0)。4.13TE缓冲液：配制每升TE缓冲液，应在800mL水中依次加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL,O.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL，加水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。1DB22/T2079—20144.14CTAB沉淀液：0.5%CTAB，0.04mmol/LNaCl。4.15蛋白酶k溶液（20mg/mL）4.16引物及探

6、针序列：天然皮革中牛、羊、猪PCR检测引物信息见表1。表1牛、羊、猪PCR检测引物信息检测基因引物序列基因性质适用范围哺乳动物特上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’12SrRNA基因皮革及其加异基因下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’工品探针：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’牛内源基因上游引物：5’-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3’牛生长素基因牛皮及其加下游引物：5’-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’工品探针：5’-

7、（FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3’羊内源基因上游引物：5'-ACACAACTTCTACCACAACCC-3'羊线粒体羊皮及其加下游引物：5'-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3'ATPase亚基工品探针：：5'-(FAM)–ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3’猪内源基因上游引物：5'-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’猪线粒体猪皮及其加下游引物：5'-TGCCAAGCGGGTTGCT-3'D-LOOP基因工品探