db22t 2050-2014 动物源性饲料中猪源性成分测定实时荧光pcr方法

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1、ICS65.120B46备案号：41838-2014DB22吉本标准仅供内部使用不得翻印林省地方标准DB22/T2050—2014动物源性饲料中猪源性成分测定实时荧光PCR方法本标准仅供内部使用不得翻印Determinationofporcinederivedmaterialsinanimal-originatedfeedstuffsReal-timePCRmethod2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2050—2014本标准仅供

2、内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、华蕾、王潇、亓晓艳、王颖、冷喜芳、吴桐、陈颖。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2050—2014本标准仅供内部使用不得翻印动物源性饲料中猪源性成分测定实时荧光PCR方法1范围本标准

3、规定了动物源性饲料中猪源性成分的实时荧光PCR检验方法，该方法的检出限为0.1%。本标准适用于动物源性饲料中猪源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义本标准仅供内部使用不得翻印下列术语和定义适用于本文件。3.1猪源性成分porcine-derivedmaterials猪种

4、属特异性DNA片段。3.2实时荧光PCRrealtimePCR实时荧光聚合酶链式反应。3.3Ct值cyclethresholdvalue每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理对样品进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，检测饲料中猪源性成分。5试剂除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。1DB22/T2050—20145.1引物和探针a)上游引物：5’-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’b

5、)本标准仅供内部使用不得翻印下游引物：5’-TGCCAAGCGGGTTGCT-3’c)探针：FAM-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA–TAMRA5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4动

6、物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.5RNaseA酶：冻干品，不含DNase。5.6蛋白酶K：冻干品。5.775%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂。5.8Tris饱和苯酚。5.9三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.10三水合乙酸钠、氯化钠。5.11十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide，CTAB）。5.12乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。5.1310本标准仅供内部使用不得翻印×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化

7、钾（KCl），15mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.14RNaseA酶溶液：用高压灭菌的去离子水溶解RNaseA酶为10g/L的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.15蛋白酶K溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶K为20mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.16乙酸钠溶液，3mol/L：在80mL水中，加入40.81g三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值到5.2，用水定容到100mL，分装后高压灭菌。5.17Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去离子水中溶解121.1gTri

8、s，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。5.18EDTA，0.5mol/L，pH8.0：称取186.1gEDTA-Na2·2H2O，加入700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH