肠炎沙门菌和雏沙门菌fimh基因缺失株的构建及相关功能性分析

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2、／争２巧００９：朱国强教授Ｔｙ：指导教师姓名，扬州大学，江苏扬州，＇？申请学位级别＝硕壬学科专业名称＝微生物学论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月４号学位授予单位：扬州大学学位授予日期；２０１５年６月古一－＾＾．答辩委员会主席：郭爱珍教授＇＊＂＾ｆ０＾職＾、／攀冷资挺％如过、參．？＜４－梦廣Ｖ伊祭Ｖ乂、．；；兴＜｜＾、、一．＇．，＇＊：，子－參疋每吟義沪挣－養疋－．作入；＇、；繁＾；＾若壑矣巧终鸾餐＾；＾？．—＊．．户

3、火？？／人占六ｆ．六、讀｜Ｗ肠炎沙口菌和维沙口菌／／ｗ／／基因缺失株的构建及相关功能性分析Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆ庐班巧ｇｅｎｅｄｅｌｅ村ｏｎｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍＳａｌｍｏｎｅＵａＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ／Ｓ本ｌｉｌｌｏｒｕｒｎｓａｎｄｒｅｌａｂｅｌ化ｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ研究生：王勇祥导リ甲：朱国强教授扬州大学畜禽病原微生物研究室２０１５年６月’王勇样＝肠炎沙口菌和维沙口菌／ｉｗＷ基因缺失株的构建及相关功能性分析Ｉ肠

4、炎沙口菌和维沙口菌基因缺失株的构建及相关功能性分析中文摘要一种重要的人畜共患病病原菌，具有广泛的宿主谱肠炎沙口菌是，能引起人和动物肠道或全身性疾病。维沙口菌属于专嗜性病原菌，可引起不同日龄的鸡感染发病，耐受鸡长期带菌且生长发育迟缓，给养禽业造成巨大的经济损失，同时也严重威胁人和动物的健康。沙口菌属经曰感染宿主，然后通过对麻上皮细胞或位于派氏结淋己组织的侵袭，将感染的吞幢细胞移动到淋己细胞，细菌在此开始繁殖。在此过程中，沙口菌对宿主细胞的黏附是引起宿主致病的先决条件。鉴于Ｆｉｍ

5、Ｈ的功能研究大多集中在尿道致病性大肠杆菌ＵｒｏａｔｈｏｅｎｉｃＥｓｃＡｅＷｃＡｗＣ０化ＵＰＥＣ）对尿道表皮细胞的黏附方面，而对肠炎沙口菌（ｐｇ和维沙口菌致病进程中ＦｉｍＨ所参与的生物学功能却鲜有报道。本研究ＷＩ型菌毛ｙｉｗＷ基因为切入点，探巧其在肠炎沙口菌和维沙口菌中所发挥的生物学功能。通过构建肠炎沙口菌Ｉ型菌毛主要亚单位ＦｉｍＡ原核表达载体，并制备鼠源多克隆－抗体，利用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ验证肠炎沙口菌和维沙口菌Ｉ型菌毛的表达。本研究通过比对Ｇ一ｅ泌ａｎｋ上沙口菌Ｉ型菌毛片基因序

6、列，设计对ＰＣ民引物扩増肠炎抄口菌ＣＭＣＣ％和一脚５０３维沙口菌１５２１８１型菌毛的抑《好基因序列，根据ＰＣＲ测序结果设计’’对同源重组引物，其５端与卿Ｊ好基因序列两侧同源，而３端与氯霉素抗性基因ｃａｒ表达盒同源－ｅｄ。利用Ｘ隆菌体Ｒ同源重组系统对肠炎沙口菌标准株ＣＭＣＣＢ５０３３６和维沙口（）菌标准株１５２１８的伽好基因进行敲除。首先，Ｗ质粒ｐＫＤ３为模板扩增含有氯霉素抗性的ＰＣＲ产物，经纯化后分别电转化至含质粒ｐＫＤ４６的肠炎沙口苗ＣＭＣＣ脚５０巧６和维沙口菌１５２１８中，在Ｒｅｄ同

7、源重組酶Ｅｘｏ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍ的作用下，含有氯霉素抗性基因片段的产物借助两翼同源序列与染色体上的鞭基因发生重组，置换抑ｗｉ／基因，分别获得一二次重组菌５０３３６４／？ｗ好；．和１５２１８Ｚ＼／？ｗ巧；ｃａｆ。在次重组中，将编码ＦＬＰ重组酶的质粒ｐＣＰ２０分别电转化入５０３３６４／？ｗ巧乂瓜１５２１８Ｚ１伽化ｅ如突变株中，通过对ｃａｆｎ扬州大学硕±学位论文。阅读框两侧的ＦＬＰ位点的识别，从而消除氯霉素抗性基因最后通过ＰＣＲ检测和ＤＮＡ测序结果，验证缺失株５０３３６＾？ｗ好和成功构

8、建。血凝试验和酵母凝＿／集试验表明，肠炎沙口菌能发生明显的凝集现象，而缺失突变株丧失凝集能力。生物被膜定性和定量试验证明ＦｉｍＨ促进肠炎沙口菌生物被膜的形成。此外，在肠炎沙口Ｆ－ｉｍＨＨＤ１１，菌中，促进对禽巨唆细胞的黏附。然而维沙口菌既不能与红细胞和酵母ｅａ－细胞发生凝集反应，也不能对禽巨懂细胞进行黏附。ＲｌＴｉｍｅＰＣＲ试验结果湿示，诚好＿／）近的转录缺失上调