肠炎沙门菌lpfc和stdb基因缺失株的构建及其相关功能的初步研究

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2、扬州，２２５００少二．’、江苏扬州，２２５００９：戈／户李求春副教授，扬州大学，式ｙ、－申请学位级别去学科专业名称：遗传学．ｒ；硕ｘ：２０１５．５２０１５．５论文提交日期：论文答辩日期：．、。＇１１６；拐州大学学位授予曰期：２０‘Ｉ学位授予单位＿户户、：亚：答辩委员会主席栽择—．ｖ栏Ｖ、．矿Ｖ卢誇《￥’＾筆，巧為＾巧＞公品三＾：２兴＇‘只；－：Ａ乂Ｖ每巧餐＆才年－—：如扛瀉讀謂ｒｃ篆瓷！１、■鲜，；於托知＇馬公餐．妄’肠炎沙瞄Ｉ忙和

3、ｓｄＢ１Ｉｒｐｔ堪因缺乂株的构建及扣相关功能的初步研究肠炎沙口菌ＩｐｆＣ和ｓｔｄＢ基因缺失株的构建及其相关功能的初步研究研究生：王晓春导师：焦新安教授李求春副教授中文摘要肠炎沙口菌沒ｌｍｏｎｅｌｌａＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉミＳＥ是革兰阴性兼性胞内寄生菌，主要寄生在人和动）（。物的肠道内，可引起胃肠炎甚至严重的全身性感染，是重要的人兽共患病病原菌肠炎沙口菌有周身鞭毛和菌毛，，可Ｗ运动。菌毛可Ｗ调节细菌巧宿主的相互作用巧细菌的致病性，、生物膜的形成、运动性、黏附和

4、肠道定殖有关同时也是肠炎沙口菌中重要的毒力因一ＴＳ子之，。在本实验室前期研究中利用ＳＣＯ技术在筛选和鉴定肠炎沙口菌感染ＲＡＷ２６４－ｆＣ．７和ＨＤ１１巨唆细胞的过程中发现：Ｉｐ和ＳｔｄＢ基因在胞内的转录水平显著高于体外培养状态，这两个基因分别属于Ｌｐｆ长极性菌毛操纵子和Ｓｔｄ菌毛操纵子家族，但国内外对两基因的功能研究鲜有报道。本研究利用同源重组的方法成功构建了肠炎沙口菌Ｃ５００４１的ＩｐｆＣ、ＳｔｄＢ基因缺失株及回复株，评价了缺失株和回复株的生物学特性，比较其一与野生株在感染细

5、胞能力，、同家族其它基因表达量及小鼠致病能力等方面的差异初步探讨了肠炎沙口菌在感染宿主过程中ＩｐｆＣ和ＳｔｄＢ基因发挥的作用。１腻炎沙口菌Ｃ５００４１ＡｌｐｆＣ和Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢ缺失株的构建与鉴定本文利用自杀质粒介导的同源重组技术构建了肠炎沙口菌Ｃ５００４１株的ＩｐｆＣ和ＳｔｄＢ基因缺失株Ｃ５００４１ＡｌｐｆＣ和Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢ。同时，分别将ＩｐｆＣ和ＳｔｄＢ基因克隆至质粒ＰＢＲ３２２５００４１ｌｆ０４１ＡｓｔｄＢＲ。并电转入缺失株中，构建了回复株ＣＡｐＣＲ和Ｃ５０比较

6、野生株Ｃ５００４１、ｆＣＲ缺失株Ｃ５００４ｌＡｌｐｆＣ、Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢ及回复株Ｃ５００４１Ａｌｐ和Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢＲ的基本生物学特性。生物学特性分析显示；ＩｐｆＣ和ＳｔｄＢ基因的缺失不影响Ｃ５００４１的生长特性巧生化特性，且两缺失株具有良好的遗传稳定性。但是缺失株Ｃ５００４１ＡｌｐｆＣ对ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的一ＬＤｓｏ是野生株的２倍，缺失株Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢ对ＢＡＬＢ化小鼠的ＬＤｓ是野生株的王分之。ｏＳｄＢ基因的缺失ＩｐｆＣ基因的缺失使肠炎沙口菌对ＢＡＬＢ

7、化小鼠的毒力有所降化，而ｔ使肠２扬州大巧硕丄学化论文一，这为进步研究肠炎沙口菌Ｌｆ炎沙口菌对ＢＡＬＢ化小鼠的毒力有所增强ｐ和Ｓｔｄ菌毛的功能奠定了基础。２肠炎沙口菌ｓｔｄＢ基因功能的初步研究本研究通过体外细胞感染实验、细胞因子和菌毛操纵子其它基因表达量的检测及小鼠体内细菌动态分布实验等开展对肠炎沙口菌ＳｔｄＢ基因的功能初步研究。实验结果表明：缺－失株对细菌的运动力没有影响，但是对ＩＰＥＣＪ２细胞黏附和侵袭的能力极显著减弱＜＜０－（０．０１）ＲＡＷ２６４．７的侵袭能力

8、有显著性差异（．０５）。ＰＣＲ方法发ｐ，同时对ｐ利用ＲＴ现体外培养试验结果和体外感染细胞ＲＡＷ２６４．７试验结果中缺失株的ｓｔｄＡ、ｓｔｄＣ和ｓｔｄＦ基因表达量都降低。用Ｃ５００４１、Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢ和Ｃ５００４１ＡｓｔｄＢＲ分别黏附和侵袭ＲＡＷ２６４．７－－细胞后，利用ＲＴＰＣＲ方法测定了炎性因子的表达量变化ＩＬ１２，在此过程中的表达量都＜是极显著性降低０．０１）。在ＣＢＡ小鼠动物感染模型试验结，缺失株和野生株（ｐ果中显示分别