肠炎沙门氏菌t3ss效应蛋白相关基因缺失突变株的构建及其生物学特性的研究

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1、肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因缺失突变株的构建及其生物学特性的研究ConstructionandBiologicalCharacteristicofSalmonellaEnteritidisMutantswithDeletionofGenesEncodingT3SSEffectors[本文受公益性行业(农业)科研专项(201303044)；江苏高校优势学科建设工程项目资助]研究生：姜逸专业：预防兽医学导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2013年6月姜逸：肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关

2、基因缺失突变株的构建及其生物学特性的研究!肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因缺失突变株的构建及鞋鬻。譬白≯究～幽嬲研究生：姜逸～～—二【二!竺?摘要肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)能够感染人和动物，是常见的人畜共患病原体。由SPI．1和SPI．2编码的III型分泌系统(T3SS)是沙门氏菌致病重要的毒力因子，不同T3SS的效应蛋白在细菌致病的各个阶段发挥不同的作用。目前对这些效应蛋白的研究主要是以鼠伤寒沙门氏菌为模型的，但它们在不同血清型沙门氏菌中的功能可能不一致。本研究选取了在肠炎

3、沙门氏菌T3SS的6个效应蛋白基因，采用LRed同源重组法构建相应的缺失株，初步探讨了这些效应蛋白与致病性的关系，为进一步深入研究肠炎沙门氏菌感染过程中T3SS效应蛋白的分子机制奠定了基础。1．肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备通过PCR扩增效应蛋白SspH2、SIrP、SseL的完整基因序列，分别克隆至两种不同的原核表达载体pET-32a(+)和pGEX一6p一1，构建pET-32a—SspH2、pET-32a—SIrP和pET-32a．SseL以及pGEX⋯6p1SspH2、pGEX一

4、6p一1一SlrP和pGEX一6p一1一SseL的重组质粒，并将其转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS—PAGE的结果分析，这六种重组蛋白均能够表达，并且蛋白大小与预期一致。可溶性分析结果显示，六种融合蛋白部分存在于细菌的裂解上清中。将纯化后的GST融合蛋白免疫家兔，以His标签融合蛋白为抗原的间接ELISA法检测免疫后的效价情况，结果显示三免14天后获得了针对SspH2、SlrP、SseL蛋白的高效价抗血清。2．肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因缺失株的构建以一株肠炎沙门氏菌C50041为母本，采用

5、Red同源重组法构建SspH2、P妒、SseL、SopE2、SlrP和SipB这6个基因的缺失突变株，PCR扩增以及突变株序列测序结果证明了这6个基因突变株的构建成功。使用第一章中制备的SspH2、SlrP和SseL融合蛋白的抗血清作为一抗，通过Western—blot的方法对缺失株的这三种蛋白的表达情况进行检测，结果II扬州大学硕士学位论文显示ASspH2、ASseL和ASlrP检测不到相应的效应蛋白，其它基因的缺失对这三种蛋白的表达不产生影响。细菌的生长曲线和血清杀菌结果显示，这些效应蛋白基因的缺失对细菌的

6、生长速度无明显影响，细菌的表面结构和渗透性也未发生明显的改变。3．肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白的致病作用对野生株C50041和ASopE2、ASipB、APipB、ASseL、ASspH2、ASlrP缺失株进行HeLa细胞的黏附和侵入试验以及HDll巨噬细胞内增殖试验。结果显示，与野生株和其它基因缺失株相比，ASipB缺失株的黏附和侵入能力出现了较为显著的下降，而SseL基因的缺失，使得C50041对HeLa细胞的黏附和侵入能力得以增强。巨噬细胞内增殖试验中，各组细菌的增殖率无明显变化。细菌侵入HeLa细胞后不

7、同时间点细胞因子表达水平的结果显示，IFN．"TNF．C【以及IL．18的表达水平差异不明显，而ASspH2在侵入HeLa细胞6h时，IL．8的表达水平显著高于野生株；APipB在侵入HeLa细胞6h时，IL．1B的表达水平显著高于野生株C50041。1曰龄雏鸡致死性试验结果显示，缺失株ASipB、ASseL和△SlrP的LD50均高于野生株C50041，其qbASipB缺失株的毒力下降最为明显；而缺失株APipB、ASopE2和ASspH2的LDs0均低于野生株C50041，特别是ASspH2缺失株的毒力增强

8、最明显。本文成功构建了肠炎沙门氏菌6个效应蛋白基因的缺失株，缺失效应蛋白SipB和SIrP可降低其毒力，缺失效应蛋白SspH2和PipB可增强其毒力，而缺失效应蛋白SseL和SopE2对其毒力无显著影响，pipB、SspH2、SseL和SopE2与已报道的在鼠伤寒沙门菌中的作用存在一定的差异。关键词：沙门氏菌、效应蛋白、缺失株、致病性、细胞因子姜逸：肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因