沙门氏菌分离鉴定、生物被膜形成相关基因缺失突变株的构建及生物学特性研究

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1、沙门氏菌分离鉴定、生物被膜形成相关基因缺失突变株的构建及生物学特性研究IsolationandIdentificationofSalmonella，ConstructionandBiologicalCharacteristicsofDeletionMutantsofGenesforBiofilmFormationfromSalmonellaPnllorum国家自然科学基金(30871872)国家十一五科技支撑计划(2009BADB9801)高等学校博士学科点专项基金(2006117005)研究生：孙化露专业：预防兽医学导师：彭大新教授

2、陈素娟副教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2012年5月孙化露：沙门氏菌分离鉴定、生物被膜形成相关基冈缺失突变株的构建及生物学特陛研究!沙门氏菌分离鉴定、生物被膜形成相关基因缺失突变株的构建及生物学特性研究硕士研究生：孙化露导师：彭大新教授陈素娟副教授刘秀梵教授摘要禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属一个或多个成员所引起的急性或慢性传染病，临床上多表现为败血症和肠炎等。沙门氏菌可以形成生物被膜，生物被膜的形成增加了细菌对不利条件的抵抗力，是细菌持续感染和反复感染的重要原因。本研究对动物源性沙门氏菌进行分离鉴定，测定其血清型、生物被膜形成能力和耐药性

3、；采用Red同源重组法构建了与鸡白痢沙门氏菌生物被膜形成相关基因的缺失株，并且初步探讨了生物被膜与致病性的关系，为进一步研究沙门氏菌生物被膜在致病过程中的作用提供了实验依据。1．动物源性沙门氏菌的血清型、生物被膜形成能力和耐药性分析从不同动物病料中分离细菌，以PCR方法鉴定沙门氏菌，结合玻片凝集法和16SrRNA序列测定确定沙门氏菌的血清型和分布，结晶紫染色定量法检测分离株的生物被膜形成能力，药敏试验检测分离菌对常用药物的敏感性。结果显示，共分离鉴定出58株沙门氏菌，主要包括鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、丙型副伤寒沙门

4、氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌和阿哥那沙门氏菌7种血清型，其中鸡群以鸡白痢沙门氏菌感染为主，肠炎沙门氏菌次之；水禽以鼠伤寒沙门氏菌感染为主。生物被膜测定结果显示51．72％的沙门氏菌分离株可形成生物被膜，其中鼠伤寒沙门氏菌83．33％可形成生物被膜。19种抗生素(氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、林可酰胺类、氯霉素类、青霉素类、四环素类和里扬州大学硕士学位论文头孢菌素类)敏感性试验表明所有菌株对林可霉素耐药，51．72％对4种及其以上抗生素耐药，并出现了对所有受试抗生素均耐药的鼠伤寒沙门氏菌。因此，鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌

5、和肠炎沙门氏菌是目前在家禽中流行的优势血清型；具有生物被膜形成能力和多重耐药性的沙门氏菌将对家禽疾病控制和公共卫生带来更大的威胁。2．鸡白痢沙门氏菌生物被膜形成相关基因缺失株的构建以一株生物被膜形成能力强的鸡白痢沙门氏菌$6702为母本，采用Red同源重组法构建csgA、csgD、adrA和bcsA4个基因的缺失突变株，PCR、RT-PCR和回复试验鉴定证明4个基因缺失株构建成功。生长曲线测定显示，4个基因缺失株与野生株生长速度一致。96孔板结晶紫染色法测定缺失株的生物被膜形成能力，结果显示只有AcsgA矛rJAcsgD缺失突变株完全

6、不能形成生物被膜，而AadrA和AbcsA缺失突变株与野生株生物被膜形成能力相似。测定细菌在4种不同培养基中的生物被膜形成能力，结果表明野生型细菌及AadrA和AbcsA在TSB培养基中有更强的生物被膜形成能力。上述结果表明，鸡白痢沙门氏菌生物被膜的形成与卷曲菌毛蛋白调控基因csgA和csgD有关，而与纤维素的调控基因adrA和bcsA无关。3．鸡白痢沙门氏菌生物被膜的致病作用选择野生株矛NAcsgA、AcsgD、AadrA、AbcsA缺失突变株进行Hela细胞的黏附和侵入试验以及巨噬细胞内增值试验，结果显示各缺失株与野生株没有显著的

7、差异；1日龄SPF鸡腹腔接种攻毒试验表明，AcsgD的LD50略低于野生株，而AbcsA的LD50略高于野生株，其它突变株与野生株毒力类似。细菌体内分布试验表明，在腹腔攻毒6h后，AcsgD组的脾脏中细菌数显著增多，48h后，AbcsA组的胆汁中细菌数显著降低，其它组别与野生株无显著差异。细菌持续性感染试验表明，鸡白痢沙门氏菌至少可以在体内存留8-9周，多存在于胆汁中，且能形成生物被膜的突变株AadrA和AbcsA感染组中的细菌检测频率高于不能形成生物被膜的突变株AcsgA矛UAcsgD感染组。上述结果显示，生物被膜与细菌急性感染的致

8、病性无直接关系；生物被膜可能与细菌的持续感染有关，且鸡白痢沙门氏菌在孙化露：沙门氏菌分离鉴定、生物被膜形成相关基冈缺失突变株的构建及生物学特性研究坐鸡的体内持续感染主要存在于胆汁中。关键词：沙门氏菌；生物被膜；耐药性；突