沙门菌生物被膜形成调控基因rpoe的鉴定及缺失突变株的生物学特性研究

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2、２５００９始芝一丰―＇－刘秀梵教授，扬州大学．江苏扬州．２巧００９令申请学位级别：硕壬学科专业名称：预防兽医学，论文提交日期＝２０１５年５月论文答辩日期＝２０１５年６月２曰－学位授予单位：扬州大学学位授予日期；２０１５年６月３０曰＾八答辩委亚減＇员会主席；戴一．兰＂－＇ｆ－每－辕豪樂讓錢￣一．．－一’．＇＇．．＇’＇－．－：分广户７／ｒ，‘黄酸；沙口菌生物被膜形成调控基因左的鉴定及缺失突变株的生物学特隆研究１沙口菌生物被膜形成调控基因的鉴定及缺失突变株的生物学特性研

3、究硕±研究生：黄驳导师：彭大新教授陈素娟副教授摘要沙口茜能够引起人和动物的感染一，是种常见的人兽共患病原体。在全世界范围内广泛流行，严重威胁人类健康，同时也给畜牧业及食品加工业带来巨大的经济损失。沙口菌能够形成生物被膜，生物被膜的形成使细菌对外界环境的抵抗力増强，从而不易被消毒剂和抗生素清除，导致细菌的持续感染和反复感染。沙口菌生物被膜形成主要是由ＲｐｏＳ蛋白调控的，但也存在ＲｏＳ蛋白非依赖型生物被膜形成株。本研究利用结晶紫染色定量法ｐ测定１２０株沙口菌分离株的生物被膜形成能化通过触酶试验测定ＲｐｏＳ蛋

4、白活性，确定巧￡诚基因依赖型和非依赖型生物被膜形成株；利用建立的巧光定量ＰＣ民方法比较巧Ｃ沾基因依赖型和非依赖型生物被膜形成株在指数期和生物被膜形成期不同Ｓｉｇｍａ因子的基因表达差异；运用Ｒｅｄ同源重组系统构建巧Ｃ祀基因缺失株，并测定了缺失株的生物被膜形成能为和致病性一，为进步阐明沙口菌生物被膜形成的调控机制奠定了基础。１．沙口菌生物被膜形成相关Ｓｉｇｍａ因子的鉴定利用结晶紫染色定量法对１２０株不同来源的沙口茵进行生物被膜形成能为测定，通过、接种于刚果红和考马斯亮蓝平板美光增白剂平板测定生物被膜成分，触酶试验测定生

5、物彼膜形成株的ＲｐｏＳ蛋白活性，最后巧用建立的英光定量ＰＣＲ方法对６个Ｓｉｇｍａ因子在指数期和生物被膜形成期的基因表巧量进行测定。结果显示，沙氏菌能在刚果红和考马斯亮蓝平板上生长出四种菌落形态，分别是红色干燥粗糖型、栋色干燥粗趟型、粉色干燥粗糖型和白色光滑型菌落。巧光增白剂平板在紫外线下的英光强度与生物被膜中纤维素的含量成正比。７５％的沙口菌能够形成生物被膜，其中基因非依赖型生物被膜形成株１１株，基因依赖型生物被膜形成株７９株。构建６个Ｓｉｇｍａ因子的重组质粒标准品，利用绝－２４ｈ不同Ｓｍａ因对定量绘制出６个Ｓ

6、ｉｇｍａ因子的扩增标准曲线。选取３株代表株检测４ｉｇ子的基因表达量，结果显示巧Ｃ记基因非依赖型生物被膜形成株在２４ｈ生物被膜形成时期基因的表达量显著高于其他５个Ｓｉｇｍａ因子。说明巧＞〇￡基因可能为巧沾基因非依赖ｓ扬州大学硕±学位论文生物被膜形成株中参与生物被膜形成的Ｓｉｇｍａ因子。２．沙口菌生物被膜形成相关Ｓｉｇｍａ因子缺失突变株的构建选取两株基因非依赖型生物被膜形成株鸡白痴沙口菌Ｓ６７０２和鼠伤寒沙口菌一ｅｄＳ０１６，Ｗ及株巧ｏＳ基因依赖型生物被膜形成株鼠伤寒沙口菌Ｓ０２５。采用民同源重组－法分别构建巧Ｃ

7、记和巧〇￡基因的缺失突变株，利用ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ和回复试验鉴定证明６个基因缺失突变株构建成功。生长曲线测定显示，ｒｐｏＳ基因缺失株与野生株的生长速度无明显差异；在鸡白掏沙口菌Ｓ６７０２中，基因缺失株的生长速度高于野生株，而在鼠伤寒沙口菌Ｓ０１６和Ｓ０２５中，基因缺失株的生长速度低于野生株。结晶紫染色定量法测定缺失株的生物被膜形成能力结果思示，在ｒｐｏＳ基因依赖株Ｓ０２５中，巧ｏＳ基因缺失后不能形成生物被膜■；在非依赖株％７０２和Ｓ０１６中，巧〇５基因缺失后仍能形成生物被膜。巧基因缺失后均不能形成生物被膜。回复试验结果

8、显示，回复株与巧〇￡回复株和野生株的生物被膜形成能力类似。由此证明，巧〇￡基因为参与生物被膜形成新的Ｓｉｇｍａ因子。３．沙口菌ＷＣ也基因缺失株的致病性研究