拟态弧菌ompu基因缺失株的构建及其生物学特性分析

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1、万方数据摘要拟态弧菌（Vibriomimicus，Vm）为人和水产动物共患病病原菌，其侵入水产养殖动物的体内后，通过黏附素的识别作用下，黏附、定植于易感细胞表面生长繁殖，产生大量的毒力因子可以作用于宿主内的组织细胞，从而引起水产养殖动物腹水病的发生，导致大批量的死亡，不仅给水产养殖业带来严重的危害，同时也威胁着人类的健康。因此，对腹水病防治的研究成为重要问题。我们前期研究发现，拟态弧菌外膜蛋白U（OmpU）的N末端含有黏附素基序，重组OmpU蛋白具有免疫保护作用，抗OmpU抗体具有明显的黏附抑制作用，提示OmpU蛋白是拟态弧

2、菌的黏附素，但由于黏附抑制作用有可能是抗原抗体反应造成的空间位阻效应，所以OmpU蛋白的黏附作用仍需确认。在此研究背景下，本研究以拟态弧菌高致病性菌株04-14为亲本菌株，以OmpU基因作为研究对象，利用同源重组技术构建OmpU基因缺失株，并在此基础上比较分析野生株和缺失株在基本生物学特性、细胞黏附性和毒力等方面的差异，以期确证拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能及其所介导的致病作用，从而为筛选用于防治疾病的黏附拮抗剂奠定基础。主要研究内容包括：1重组自杀性质粒pWM91-ΔOmpU的构建根据GenBank中登录的拟态弧菌Vm22

3、3参考株的OmpU基因上、下游序列，质粒pKD3序列以及pWM91的多克隆位点，设计4对特异性引物，以鱼源拟态弧菌04-14基因组为模板，分别扩增OmpU基因的上游和下游序列；以质粒pKD3为模板，扩增Cm抗性基因片段；利用重叠PCR方法获得上、下游同源臂与Cm抗性基因的融合片段（OmpUR-CmR-OmpUL，2179bp）并克隆至质粒pUC57。测序正确后，用XhoⅠ/NotⅠ双酶切融合片段和自杀质粒pWM91，连接产物转化至宿主菌E.coliS17-1中，提取重组质粒，经过酶切后获得大小约为8261bp和2179bp两

4、条DNA条带，分别与pWM91和融合片段的大小一致。DNA测序结果亦显示3个DNA片段序列和连接顺序完全正确，说明重组自杀性质粒pWM91-ΔOmpU构建成功。2接合转移与OmpU基因缺失株的筛选鉴定以携带重组自杀性质粒pWM91-ΔOmpU的E.coliS17-1为供体菌，拟态弧菌04-14菌株为受体菌进行接合转移试验。以氨苄抗性标记和蔗糖致死性基因进行双重筛选，得到疑似OmpU基因缺失株。分别用引物对OmpU-1/OmpU-2、Cm-1/Cm-2、OmpUL-1/Cm-2、Cm-1/OmpUR-2对OmpU基因缺失株进行

5、组合PCR鉴定，结果分别扩增出大小为1072、1013、1674和1525bp的目的基因片段，测序鉴定结果亦证明OmpU基因缺失株构建成功。I万方数据3OmpU基因缺失株的基本生物学特性测定在构建OmpU基因缺失株的基础上，对缺失株的遗传稳定性、形态染色特性、生长特性、培养特性和生化特性等基本生物学特性进行测定。结果发现，连续传代25代后突变株均能稳定遗传；缺失株较野生株生长速率缓慢，丧失了分解麦芽糖的能力；但野生株与缺失株的形态染色特性、培养特性和其他生化特性没有明显差异。4OmpU基因缺失株的细胞黏附性测定以鲤鱼乳头状上

6、皮瘤细胞（EPC）为体外细胞黏附模型，对比研究OmpU基因缺失株和野生株的细胞黏附能力。将缺失株与野生株分别和EPC细胞于室温下共孵育60min，洗去未黏附的细菌后，同时采用显微镜检查法和细菌计数法检测细菌对EPC细胞的黏附情况。结果发现野生株与缺失株对每个细胞的平均黏附菌数分别为32.3±4.5和10.8±0.5，PBS空白对照组的细胞形态完好，无细菌黏附。以野生株对EPC细胞的粘附能力作为参照，OmpU基因缺失株黏附细胞的能力显著下降了66.6%（P＜0.01），说明OmpU蛋白是拟态弧菌的黏附素。5OmpU基因缺失株的

7、毒力测定为了研究OmpU蛋白对拟态弧菌毒力的影响，测定OmpU基因缺失株和野生株的对实验草鱼的半数致死量LD65550。即将野生株分别以1.92×10、7.68×10、3.06×10、1.22×105和4.88×104CFU/fish腹腔注射体重50g左右的实验草鱼，缺失株分别以11.25×106、7.5×106、6×106、4×106和2.67×106CFU/fish腹腔注射实验草鱼，注射后各组鱼转移至不同的鱼缸饲养，并将水温控制在28±1℃，观察记录14天内实验鱼的发病和死亡情况，并根据Reed-Muench法计算突变株

8、和野生株的LD50。结果显示，野生株和缺失株的LD6650分别为1.07×10CFU/mL和4.43×10CFU/mL，与野生株毒力比较，缺失株的毒力降低了4倍。综上所述，本研究从反面即分子水平上确证了拟态弧菌OmpU蛋白具有黏附功能，并且参与细菌的致病作用。关键词：拟态弧菌，OmpU基因