单核细胞增生性李斯特菌hfq基因缺失株的构建及其生物学特性研究

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1、单核细胞增生性李斯特菌hfq基因缺失株的构建及其生物学特性研究研究生：康美琴导师：殷月兰副教授焦新安教授中文摘要单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是革兰阳性的短杆菌，营腐生和寄生生活，是重要的食源性人兽共患病原菌。该菌在环境中广泛分布，对低温、酸碱和高渗透压等环境抵抗力极强，是宿主谱较广的兼性胞内寄生菌。Lm在各种环境中适应、生存并表现致病力，与调控因子的网络调控密切相关。Hfq蛋白是Lm中新发现的调控因子，在该菌生长代谢及毒力调控中的作用知之甚少。不同血清型Lm的生态分布和致病性存在较大差异，本文分别以血清型为1／2a的标准株EGDe和4b的高毒力菌

2、株NTSN为研究对象，利用同源重组技术构建了hfq基因缺失的突变株及回复株，比较其与野生株对环境胁迫及小鼠致病特性，探索调控因子Hfq在Lm致病及抵抗外界压力方面的作用。1．单核细胞增生性李斯特菌hfq缺失株及回复株的构建与鉴定利用同源重组技术分别成功构建了单核细胞增生性李斯特菌EGDe菌株及NTSN菌株办向基因的缺失株。在扩增出待敲除基因两翼的同源片段之后，利用SOEingPCR方法将其拼接在一起，插入穿梭载体pKSV7中，经电转化导入EGDe和NTSN感受态细胞中。通过温度和氯霉素抗性压力，实现两次同源重组，对重组克隆用PCR方法和RT-PCR方法进行鉴定，将阳性克隆命名为EGDeAhf

3、q、NTSNAhfq。另外，将hfq基因及其启动子序列构建进pERL3质粒中，通过电转化的方法导入感受态细胞NTSNAhfq中，获得物基因回复株，命名为NTSNAhfq一桷。对亲本株、物缺失株及回复株的生长曲线、生理生化特性、溶血活性进行了测定。实验结果表明，EGDeAhfq、NTSNAhfq的生长趋势与野生株相似，溶血活性未发生明显变化，但EGDeAhfq丧失0【葡萄糖苷酶活性，NTSNAhfq丧失亮氨酸芳胺酶(LeuA)活性及乳糖氧化能力(LAC)，表明桷基因的缺失对细菌正常的生长未造成明显影响，但对碳源、氮源代谢途径中的特定代谢通路造成一定的影响。2单核细胞增生性李斯特菌hfq基因缺失

4、株生物学特性研究Hfq蛋白广泛存在于革兰阴性菌和某些革兰阳性菌中，能同时调控大量靶标基因的表三扬划盔堂亟主堂鱼淦塞达，进而在包括致病在内的多个细胞过程中发挥整体调控作用，有利于细菌对体内外生存环境的适应。本研究通过体外胁迫培养、细胞侵袭和小鼠感染实验，对其表型特征、抗胁迫能力及细菌致病力等进行研究。实验结果表明：于4℃低温环境下，缺失株生长较野生株显著下降(p<0．05)，在含7％NaCl高渗BHI培养基及4．5％乙醇的BHI培养基中，缺失株生长受到明显抑制。此外，EGDeAhfq和NTSN△hfq对1％TritonX．100敏感性显著增加(p

5、基中，缺失株形成生物膜的能力显著下降p<0．05)，对Caco．2细胞系的侵袭能力降低。突变株对BALB／c小鼠的毒力测定结果表明，EGDe△hfq半数致死剂量比野生型菌株提高6倍(LD50分别为5．92X105CFU和3．94×106CFU)，毒力显著降低，NTSNAhfq半数致死剂量比野生型菌株提高16倍(LD50分别为2．88×10’CFU和4．72×106CFU)，毒力显著降低。上述实验结果表明，nfq蛋白对Lm抗胁迫、生物膜形成及细菌毒力具有重要的调控作用。缺失株的构建及其生物学特性的测定为进一步研究Hfq的功能提供了材料，为研究其在Lm胁迫环境生存及疾病预防控制奠定了基础。关键词

6、：单核细胞增生性李斯特菌，突变株，办向基因，同源重组，压力应激，生物膜，毒力，生物学特性鏖羞茎垫缝绁盥塑生世奎逝挂笪鱼应基国筮塞拯的掬建丛墓生物堂挂世班窥!ConstructionandcharacterizationofListeriamonocytogenesAhfqmutantstrainsM．S．candidate：MeiqinKangAdvisors：AssociateProf．YuelanYinProf．Xin’anJiaoAbstractlIlllq11111qlllllLLIllIttlllillllllltlllY2632990Gram．positivebrevibacte

7、riumListeriamonocytogenes(Lm)isanimportantzoonoticfoodbomepathogenengaginginbothsaprophytismandparasitism．Asafacultativeintracellularparasiticbacterium，Lmhasrelativelybroadhostspectrum．Inaddition，ithasstron