单核细胞增生李斯特菌rsbv基因缺失株的构建及其毒力和环境耐受性的研究

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1、分类号：密级：学号：2010108051单位代码：10759石河子大学硕士学位论文单核细胞增生李斯特菌RsbV基因缺失株的构建及其毒力和环境耐受性的研究学位申请人张再超指导教师乔军教授申请学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月Construction,virulenceandenvironmentaltoleranceof∆RsbVdeletionstrainofListeriamonocytogenesADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPa

2、rtialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangZaichao(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.QiaoJunShihezi·Xinjiang·ChinaJune,2013项目资助（1）项目名称：prfA基因突变对单核细胞增生李斯特菌毒力和免疫原性的影响；国家自然科学基金资助项目（NO：30960276）；（2）项目名称：单核细胞增生李斯特菌LIPI-1致病岛的基因改造及重组菌生物学特性研究；

3、家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放课题资助项目（NO：KEYLAB200906）；（3）项目名称：单核细胞增生李斯特菌LIPI-1致病岛的基因改造研究；石河子大学高层次人才专项（NO：RCZX200801）；摘要单核细胞增生李斯特菌（listeriamonocytogenes,LM）是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌，可以引起孕畜（妇）流产和脑膜炎等疾病，是对人畜具有较大危害的人兽共患病病原。该菌广泛存在于水和土壤等自然环境中，具有很强的环境适应能力，可在酸性、高盐和低温等多种复杂环境压力下生存，这也是近年来“李斯特菌病”高发的重要原因。免疫接种是预防动物传染病发生的重

4、要手段，但是灭活苗免疫对李斯特菌病效果不佳，所以研发LM弱毒疫苗具有重要的意义。LM可穿越宿主的主要生理屏障（肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障），侵入机体后能在专职和非专职吞噬细胞(如上皮细胞、肝细胞及成纤维细胞等)中繁殖和寄生，其胞内寄生和细胞间扩散需要特定毒力因子的参与。LM不仅毒力基因众多，调节机制也非常复杂，存在着多级调控系统。现有的研究表明，LM的毒力主要受到正调节因子PrfA、应答调控因子VirR和环境应激因子SigmaB因子的调控。SigmaB操纵子可以编码RsbR,RsbS,RsbT,RsbU,RsbV,RsbW,SigmaB和RsbX共8个因子，其中Sigm

5、aB因子对PrfA、inlA、inlB和LLO等主要毒力因子具有调控作用，然而关于RsbV因子在LM毒力和环境耐受性调控方面的作用尚不清楚。鉴于此，本研究构建了LMRsbV基因缺失株，并开展了缺失株毒力、免疫原性和环境耐受性研究，探讨了LM的RsbV因子在其毒力和环境耐受性方面的调控作用，为LM弱毒疫苗的研发提供了科学依据。主要研究内容和结果如下：1、LMRsbV基因缺失株的构建与分子鉴定：利用PCR技术扩增出RsbV基因两侧的上游同源臂和下游同源臂，然后运用基因重叠PCR（SOE-PCR）技术获得RsbV基因缺失片段。将RsbV基因缺失片段插入到穿梭载体PKSV7中，

6、构建重组穿梭质粒pKSV7-△RsbV。将pKSV7-△RsbV电转化到LM-XS5中，用检测引物对电转后的菌株和传代培养的菌株进行PCR鉴定和测序分析。结果筛选得到可以扩增出807bp和479bp两条目的片段的阳性转化子；对阳性转化子在氯霉素压力42℃条件下传代培养15代，获得具有氯霉素抗性的单交换重组株；然后再在无氯霉素压力42℃条件下传代培养15代，得到只能扩增出479bp一条目的片段无氯霉素抗性的双交换基因重组缺失株LM-△RsbV；继续在无氯霉素压力37℃条件下传达培养20代，LM-△RsbV无毒力返祖现象，说明该菌具有遗传稳定性。2、RsbV基因缺失对LM毒

7、力和免疫原性的影响：通过人工感染小鼠后，通过LD50、肝脾载菌量、毒力基因转录水平的检测和巨噬细胞RAW264.7侵染实验分析了缺失株LM-△RsbV和野毒株LM-XS5在毒力上的差异；通过小鼠免疫攻毒实验，研究了LM-△RsbV对小鼠的免疫保护效果。结果显示LM-△RsbV的LD9.8150为10CFU，LM-XS5的LD5.56450为10CFU，LM-△RsbV的LD50是野毒株的10倍（P<0.01）；在不同时间点，缺失株LM-△RsbV在小鼠肝和脾内的载菌量均少于LM-XS5（P<0.05）；荧光实时定量PCR检测结果发现，缺失