单核细胞增生李斯特菌ncrna rli60基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

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1、分类号：密级：学号：2012108026单位代码：10759石河子大学硕士学位论文单核细胞增生李斯特菌iicRNAr//如基因缺失株的构建及部分生物学特性研究学位申请人彭叶龙指导教师乔军教授申请学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国•新繮•石河子2015年6月分类号：密级：学号：2012108026单位代码：10759石河子大学硕士学位论文单核细胞增生李斯特菌ncRNArli60基因缺失株的构建及部分生物学特性研究学位申请人彭叶龙指导教师乔军教授申请学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学

2、所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月ConstructionandPartialBiologicalCharacteristicsofncRNA∆rli60DeletionStrainofListeriamonocytogenesADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByPengYelong(PreventiveVeterinaryMedicine)Disserta

3、tionSupervisor:Prof.QiaoJunJune,2015中文摘要单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes,LM）是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性致病菌，可以引起人和动物流产、脑膜脑炎、败血症等症状，是一种对公共卫生安全和畜牧业生产危害较大的人兽共患病原菌，被世界卫生组织（WHO）认定为四大食源性致病菌之一。该菌广泛存在于自然环境中，对低温、高渗、酸性、碱性、消毒剂等外界环境具有广泛适应性，这种毒力和应激能力与其表达的毒力因子、环境应激因子以及相关调控分子密切相关。非编码RNA(ncRNA)作为一种调控分子可以通过调节毒力基因

4、和环境应激相关基因的表达来影响LM毒力及其环境应激能力。目前，利用生物信息学及分子生物学技术在LM中已经鉴定出多种ncRNAs，这些ncRNAs与LM毒力、环境应激、金属离子转运、生物膜生成、糖代谢、侵染、胞内寄生等生命活动密切相关。Rli60属于LMncRNAs中的成员之一，其功能至今尚不清楚。鉴于此，本研究利用同源重组技术构建rli60及ncRNA伴侣分子hfq基因缺失株，通过分析缺失株与母源株毒力和环境应激等表型差异并研究Rli60调控相关基因相对转录水平变化，以期揭示Rli60对LM毒力和环境应激的调控作用。研究方法和主要研究结果如下：1.LMncRNA

5、rli60和伴侣分子hfq基因的克隆、分子特征分析及其缺失株的构建与鉴定扩增、克隆LM-SB5rli60及伴侣分子hfq基因并测序，对ncRNARli60二级结构、潜在作用靶点及hfq基因的分子特征进行分析。分别扩增rli60及hfq基因上、下游同源臂，采用重叠延伸PCR（SOE-PCR）得到rli60和hfq基因缺失的融合片段△rli60和△hfq，构建具有氯霉素抗性的pKSV7-△rli60和pKSV7-△hfq重组穿梭质粒，电转化至LM-SB5感受态细胞中，在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组；筛选无氯霉素抗性的基因缺失株，并检测其遗传稳定性。利用q

6、RT-PCR检测hfq基因缺失对rli60基因转录水平的影响。结果成功克隆了rli60和hfq基因，分析显示rli60基因全长246bp，二级结构呈“X”型茎环结构，包含9个环状结构和5段互补的双链结构，其潜在作用靶点包括hly、inlF、dltA、rsbU、gltD、mpl等与毒力及环境应激相关的基因。hfq基因全长234bp，编码77个氨基酸，对推导的Hfq氨基酸序列分析发现从N端到C端包含1个α-螺旋及5个β-折叠，具有RNA结合位点及六聚体结合位点，可能在参与LMncRNAs调节基因表达过程中发挥重要作用。同时，成功构建并筛选得到遗传性稳定的基因缺失株L

7、M-△rli60与LM-△hfq，重组缺失株经PCR鉴定得到与缺失后的预期值1543bp及1421bp相符的目的条带。在LM-△hfq中，rli60基因的相对转录水平为0.91，与LM-SB5相比其转录水平并无显著变化（p>0.05），表明Rli60在LM中可能通过不依赖于Hfq蛋白的方式发挥作用。2.ncRNArli60基因缺失对LM环境应激及生物膜生成能力的影响为了解rli60基因缺失对LM-SB5环境应激能力及生物膜生成能力的影响，通过检测LM-SB5与LM-△rli60在不同温度、pH、高渗及乙醇条件下的环境应激能力及生物I膜生成能力，并利用qRT-PC

8、R检测生物膜生成相关基因