产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建及其免疫生物学特性的研究

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1、扬州大学博士学位论丈产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建及其免疫生物学特性的研究研究生殷月兰导师焦新安中文摘要产单核细胞李斯特菌(￡括地，蛔monocytogenes，LM)是人兽共患李斯特菌病的病原，主要通过食用被LM污染的食品感染，能引发人的脑膜炎、发热性败血性胃肠炎、孕妇流产等，感染后发病死亡率约为25％。欧美国家曾多次暴发流行，LM对食品的污染与危害，已引起世界各国的普遍关注和高度重视，其中研制预防李斯特菌病的减毒活疫苗是重要的课题之一。另一方面，鉴于LM是胞内寄生菌，减毒LM是非常有前景的疫苗载体之一。为此，本研究通过同源重组的方式对血清型为l／2a的野生型

2、菌株基因组中相邻的两毒力基因actA和plcB进行缺失，获得减毒重组菌株，并以减毒株开展了以原核和真核表达的不同方式运送模式蛋白GFP的研究。为了对减毒株的免疫保护力进行评价，哕及从不同水平上证实基因的缺失，对毒力基因^咖和actA在大肠杆菌中进行丁·原核表达并对ActA蛋白进行了单抗的研制。减毒突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用，而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。此外，对于LM阐明毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。1．产单核细胞李斯特菌actA基因和^仃基因的原核表达及ActA单克隆抗体的研制利用PCR技术从血清型1／2a的L

3、M4株中扩增出actA基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达载体pGEX一6P．1．actA及pET-actA，转入终宿主菌E．coli后，IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS．PAGE电泳结果表明，actA基因在两种载体中均获得表达，融合蛋白的大小分别约为120KD和97KD。殷月兰：产单核细胞李斯特菌减毒突变株的构建及其免疫生物学特性的研究3以纯化蛋自作为免疫用抗原进行了AetA单抗的研制，获得四株抗AetA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹水单抗ELISA效价为1：5XlO'～1：l×105。选取单抗1A5进行Western-blot分析，结果表明不仅能

4、和表达产物进行特异性反应，而且与LM4多抗血清的Western-blot结果一致。这表明表达的ActA蛋白具有免疫生物学活性，同时进一步证实了单抗的特异性。actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础，也为该菌鉴定提供了新试剂。李斯特菌溶血素(LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子，利用PCR技术从血清型4b的LM菌株F4636中扩增出编码LLO的^≯基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达质粒poEx．6P．1-hly。SDS-PAGE电泳结果表明：LLO与谷胱甘肽在大肠杆菌中己融合表达，融合蛋白的分子量为

5、82KD；溶血实验证明融合蛋白具有较强的裂解真核细胞膜的作用，表明表达产物LLO具有生物活性，其溶血效价达2．26Xi04HUlmg。由于矗咖基因是LM的高度保守的基因，这为研究血清型为1／2a的菌株激发机体对LLO的免疫应答水平提供了材料，也为其致病与免疫机理、单抗研制和疫苗设计提供了条件。2．减毒突变株LM4△actA／pIcB的构建及鉴定为了确定用于减毒的产单核细胞李斯特菌菌株，对初筛入选的血清型为1／2a的菌株LMl、LM2、LM3和LM4的分子生物学特性进行了比较研究。利用PCR技术均成功地扩增出4株菌株的^耖基因、actA和plcB基因片段。以LD50的

6、测定试验作为菌株毒力指征，对4株菌株的毒力进行了测定。试验结果表明：4株菌株均为强毒菌株，其中菌株LM4的毒力最强，对BALB／c小鼠测得的IgLD50为4．19。根据以上实验结果确定以LM4作为侯选菌株。actd和plcB基因的编码产物AetA和PC．PLC是与其致病性相关的主要毒力因子，本研究通过删除这两个基因实现对血清型为1／2a的野生型菌株LM4的减毒。在扩增出待删除基因两翼的同源片段actA年llplcB后，利用SOEingPCR方法将其拼接在一起，测序后插入穿梭载体pKSV7中，经电转化导入LM4。通过温度和氯霉素抗性压力，实现两次同源重组，对重组克隆用

7、PCR方法进行4扬州大学博土=学位论文鉴定，将阳性克隆命名为LM4△actA／plcB。对野生型菌株和突变株的毒力测定结果分别为：菌株LM4的lgLDso为4．19，突变株LM4zxactA／plcB的lgLD50为7．64，表明删除了actA和plcB基因之后，菌株的毒力显著降低。以actA的原核表达产物作为抗原，以重组菌LM4aactA／plcB免疫小鼠后制各的多抗血清为一抗进行westem．blot，结果未出现97KD的免疫印记条带，从蛋白质水平上亦证实了actA基因的缺失。3．表达GFP的重组减毒突变株的构建利用SOEingPCR的方法把模式蛋白GFP与