重组ndv hn基因减毒鸡白痢沙门菌的构建及其特性研究

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文重组NDVHN基因减毒鸡白痢沙门菌的构建及其特性研究ConstructionandcharacteristicstudyofrecombinantNewcastlediseasevirushaemagglutinin-neuraminidasegeneattenuatedSalmonellaenteriaserovarPullorum学位申请人：尚珂指导教师：程相朝、余祖华一级学科：兽医学二级学科：预防兽医学学位类别：农学硕士2015年06月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取

2、得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要新城疫是由新城疫病毒引发的一种急性和高度接触性禽类疾病，对世界养禽业造成了毁灭性的破坏，世界动物卫生组织将其列入必须进行通报的动物疾病之一。近年来，由于传统疫苗对新城疫预防的种种缺陷，研制一种新型基因工程疫苗来预防和控制新城疫势在必行。鸡白痢沙门菌（S.Pullorum

3、）是目前危害养鸡业的重要细菌之一，药物控制该菌易造成生物安全问题，传统疫苗免疫力不高，因此，将减毒沙门菌作为预防细菌疾病的新型活疫苗是当下控制鸡白痢的首选途径。本试验在减毒S.PullorumC79-13∆crp的基础上，进一步缺失asd基因，利用其质粒平衡致死系统构建重组菌株C79-13Δcrp∆asd(pYA-HN)，并对其生物学及免疫学特性进行研究。1.减毒S.PullorumC79-13∆crp∆asd株的构建及其生物学特性本研究以S.PullorumC79-13∆crp作为受体菌、大肠杆菌χ7213(pREΔasd)作为供体菌，将二

4、者进行接合转移，并通过“两步法”筛选asd基因缺失株，PCR鉴定结果及测序结果显示，成功构建S.Pullorum缺失株C79-13∆crp∆asd。生物学特性结果表明，该菌在DAP阴性环境中存活的能力丧失，同时也失去了利用麦芽糖、葡萄糖、甘露醇和鼠李糖等碳源的能力；其血清型与野生株C79-13一致，生长速度减慢；能够在体外稳定遗传asd缺失基因；雏鸡口服攻毒试验结果显示重组菌株LD450较野生株C79-13升高约3.1×10倍。2.重组NDVHN减毒S.Pullorum的构建及其生物学特性本试验将PCR扩增出的HN基因片段克隆至无抗性原核表达

5、载体pYA3493，得到重组表达质粒pYA-HN，进而将经PCR及酶切鉴定正确的重组质粒导入C79-13∆crp∆asd中构建重组菌株C79-13Δcrp∆asd(pYA-HN)。该重组菌株的生化特性与生长特性与C79-13∆crp∆asd基本保持一致；NDVHN基因能够在体外稳定遗传；SDS-PAGE结果显示HN基因在重组菌中得到了表达，Westernblot结果表明表达蛋白具有良好的免疫原性；重组菌毒力较野生株C79-13升高约3.4×104倍；定植试验结果显示，重组菌对鸡体具有较好的侵袭力。3.重组菌株C79-13Δcrp∆asd(pY

6、A-HN)的免疫学特性研究重组菌株口服免疫雏鸡，对其免疫学特性进行研究。结果表明，对鸡只体重的增加与对照组相比差异不显著（P>0.05），能显著刺激鸡体免疫器官指数的增加（P<0.05）；血清HI抗体测定结果显示，HI抗体水平于免疫后21d时达到最大值（log2=5.3）；重组菌免疫后第21d免疫血清中沙门菌IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.05）；在重组菌株免疫鸡肠道冲洗液中检测到较PBS组高水平I摘要的分泌型IgA(log2=3.56)；免疫组所分离的淋巴细胞经体外刺激后其SI在免疫第21d达到最大值，即1.698，与PBS组相比差异

7、显著（P<0.05）；免疫保护试验结果显示，重组菌免疫组可能100%抵抗沙门菌野生株的感染，对NDVF48E8的攻击有60%的保护率。综上所述，重组菌免疫后在一定时期内能够刺激机体产生有效的体液、黏膜和细胞免疫应答反应，且对S.Pullorum及NDV野毒株的感染具有保护效果。关键词：NDV；HN；asd+平衡致死系统；重组减毒S.Pullorum；生物学特性；免疫学特性论文类型：应用基础研究课题来源：河南省技术厅科技攻关项目IIABSTRACTABSTRACTNewcastledisease(ND)isoneofacutecontagiou

8、saviandiseasecausedbyNewcastlediseasevirus(NDV),whichhasdevastatingdestructionandw