重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒dna疫苗的构建及其口服免疫效果研究

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1、分类号站。’４学号Ｓ２０１２３５２Ｓ？；？西川巧化大擎硕±学位论文重组减毒沙口巧菌鹏痘病毒ＤＮＡ疫苗的构建及其口服免疫效果硏究刘雪燕指导巧肺＿茹庆科巧巧巧－学科专业预防冉医学．：．研巧方向劝物微生祐与免巧学．．．．＜－―＇，－■－．？一；．Ｊ二．２０１５年５月．式＇－＇＂＇■－．／．．．．．乂＇，．．／节：；古＇。，三，？，．．、…？－＇．产．Ｖ．一？－４．？■？－＾—＊？

2、．Ｉ；．＂Ｓ、１＊＇．．ｉ．，Ｉ＇．（．．论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，，除了文中特别加１＾标注和致谢的地方外学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教巧机一构的学位或证书所使用过的材料。与我同王作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名；ｉ年月１如；＆扣ｊ关于论文使用授巧的声明本人完全了解四川化业乂学有关保留、使用

3、学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家巧レ关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被巧阅和借阅，可ッ采用影巧、缩印或扫描巧复制手段保存、汇编学巧论文。同意四川化业火学可不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内巧。，在本论文不保密。□本论文保密＿＿年解密巧适本授权。上□＂＂（请化Ｗ内划Ｖ）＇研究生签名；年６月主日（：年导师签名卢（（月ｙ日％＞、４摘要ＶＡＸ－本论文Ｗ质粒ｐｌ和ｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌ为基础，辅Ｗ重要元件ＣＧ免疫基序、核（ｐ一禪向序列、基因等，利用类生物学合成方法构建出种新

4、颖的通用型ＤＮＡ疫苗）ｋＤＮＡ－。Ｃ０Ｓ７细胞证实载体，命名为ｐ酶切连接绿色巧光蛋白基因（姆巧体外转染该质粒具有ｐＶＡＸｌ相似的真核表达能为。选取鸭痘病毒ｇＢ糖蛋白膜外区域编码基因基因和鸭正－和ＵＬ２４基因为抗原基因，大厥杆菌不耐热肠毒素Ｂ亚单位Ｅｃｏ／ｆＬＴＢ２（）ｍＲＮＡ反转录ｃＤＮＡ为分子佐剂构建多种鸭瘋病毒ＤＮＡ疫苗质粒。ＷＣ８２７６■－成ｋｒ鼠伤寒沙口氏菌ＵＫｌＡｏｉＡｃ缺失巧为口服兔疫途径递送活菌载体，２０日龄（＾＞ｗ麻鸭口服免疫重组减毒沙口氏菌鸭適病毒ＤＮＡ疫苗两次，均能产生较高的体液及粘一ＡＣ／ｋＤＮ

5、Ａ－膜免疫应答，并在定程度上抵抗鸭瘋病强毒株的挑战，其中Ｃ８２７６ａ巧巧（ｐＵＬ２４－ＬＴＢ御效果显著。结果如下：一种新颖通用型ＤＮＡ疫苗载体的构建：利用类生物学合成方法合成全新ＤＮＡｋＤＮＡ－－疫苗载体ｐ：ＷＵＫ１基因组、ｐＶＡＸｌ和ｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌ为模板ＰＣＲ扩増获得基因片段〇？／、ｐＵＣ、ＣＭＶＭＣＳ、ＳＧＨｐｏｌｙ（Ａ）、ＳＶ４０ｅｎｈａｎｃｅｒ和ＳＶ４０ｌａｔｅｐｏｌｙ（Ａ）片段；重叠ＰＣＲ两两敲合构建Ｈ模块片段：（１／２ＤＴＳＩＩ＋Ｗ如ＣｐＧ＋ＰＵＣ）、（ＢＧＨｐｏｌｙＡ＋ＣｐＧ＋ＳＶ４０ｅ

6、ｎｈ抑ｃｅｒ和ＭＶＭＣＳ＋ＣｐＧ＋ＳＶ４０ｐ〇ｌｙＡ＋ｌ／２ＤＴＳ巧；最后利用Ｇ化ｓｏｎ）（Ａｓｓｅｍｂｌｙ？ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ油ｓ？ｉｎｃ．）完成ｐｋＤＮＡ质粒的类生物合成。两次测序结果表明与理论序列相符，酶切连接绿色巧光蛋白基因（巧汝），直接巧光法可见绿色炎光蛋白在ＣＯＳ－７细胞中很好的表达，其真核表达能力与ｐＶＡＸｌ相似。Ｂ４５－鸭媪病春ＤＮＡ疫苗的构建及其体外表达能力检测；ＰＣ民扩増ｔｇ１１６５０ｂ、（ｐ）－－ＵＬ２４－、ＬＴＢ、和鸭正２基因ＰＣ艮扩増得到ＵＬ２４ＬＴＢ、ＵＬ２

7、４ＤＵ正２融合片。；重叠段ＤＮＡＤＮＡ－单抗原基因及誕合基因酶切连接ｐｋ，完成鸭瘋病毒疫苗质粒；ｐｋＤＮＡｔｇＢ、－－－－ＤＮＡＵＬ２４ｋＤＮＡＵＬ２４、ｋＤＡＮ－Ｄｕ２。ｐｋ、ｐＬＴＢｐＵＬ２４ＩＬ，测序鉴定无误所有ＤＮＡ－７细胞疫苗质粒瞬时转染ＣＯＳ，间接免疫巧光检测转染２４小时后的细胞，均可见强烈的绿色巧光信号，而空质粒转染组及空白组巧光不明显；４８小时后，收集细胞，－－－－提取总ＲＮＡＰＣ民检ＤＮＡＬＴＢＡ－ＤｕＬ２，民Ｔ测可见ｐｋＵＬ２４和ｐｋＤＮＵＬ２４Ｉ转染组中佐剂基因特异性转录。ｃ８２７６Ａｃ＃ｐ／巧

8、ａ弱毒株及重组减毒沙口氏菌鸭痘病毒ＤＮＡ疫苗菌株的构建鼠ｉＵＫ－ｌＡＡ伤寒沙口氏菌ｃ８２７６（ｗ却ｃ巧缺失株为亲