微囊化携pedv基因的减毒沙门氏菌疫苗的仔猪免疫研究

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMaster’SDegreDiertationPigletimmunitystudyofmicroencapsulatedattenuatedalmonellavaccinecarryingPEDVgenesByPanHaiboDirectedby：prof．YanQiguiJune2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也

2、不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：、溺谗啦关于论文使用授权的声明矽怿年6月f1日本人完全了解四J1I农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。／b本论文不保密。口本论文保密，在年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究

3、生签名：滔咆沮导师签名：{矜＆参-弘ttpm∥月m◇l降6月e

4、BⅢⅢⅢ、_、一⋯川(一删9一眦7一ⅢⅢ)一M¨，l，一帅2一iiii叭●I—M¨¨、，一¨¨¨¨，一，一川jjiIJ—mm叭～一万方数据中文摘要中又捅斐猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)是引起仔猪早期死亡的重要病毒性肠道传染病，给养猪业带来严重的经济损失。局部肠粘膜分泌型IgA(slgA)在抗PEDV感染中发挥着重要作用，目前采用的常规疫苗不能刺激机体产生足够的slgA，因而预防该病效果并不理想，无法有效地控制该病的区域性流行。因此研发一种可以诱导较强的粘

5、膜免疫，同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫的新型疫苗，对于控制我国PED疫情具有重要的意义。本研究以构建好的重组减毒沙门氏菌(S．C500／pVAXl一SAB、S．C500／plRES—M—N)为材料，海藻酸钠为囊材，采用乳化法制备出重组减毒沙门氏菌微胶囊，并进行了工艺的优化和性能的研究，然后将微囊疫苗口服免疫仔猪评价其免疫效果，主要研究内容如下：1、重组减毒沙门氏菌微囊的制备以单因素实验为基础，选择合适的因素和水平设计正交实验以优化微囊的制备工艺，得到最适制备工艺条件：海藻酸钠浓度为1．5％，菌胶体积比1：6，乳化剂含量0．4％，氯化钙浓度0．1％，搅拌

6、速度600rpm，乳化时间10min，该条件下制备的微胶囊包埋率34．1％，含菌量为4_31×109CFU／g。2、重组减毒沙门氏菌微囊的性能研究将制备的微囊置于人工胃酸，人工胆汁、人工肠液以及在人工模拟消化道中，考察菌体的耐酸，耐fI_B}tSH释放菌体性能。结果显示：微胶囊在人工胃液中处理4h后，存活率为73．21％；在人工胆盐溶液中处理4h后，存活率为74．07％，显著大于未微囊化重组减毒沙门氏菌的存活率；微囊制剂在人工肠液中处理120min后发生崩解，能够快速地释放菌体，具有良好的肠溶性。微囊化重组菌体经过人工模拟消化道环境处理后存活率为55．17

7、％，未微囊化重组菌存活率仅为5．42％，可见将重组菌微囊化后可以减少胃液，胆汁对菌体的杀伤作用，顺利地到达肠道。3、重组减毒沙门氏菌微囊口服免疫仔猪的研究将微囊化重组菌、未微囊化的重组菌、微囊化空载体菌、空载体菌以8．62x109CFU／头的剂量和PEDV灭活苗以1．5mL／头分别免疫仔猪，对各免疫组万方数据仔猪进行血清和粪便采集，检测免疫仔猪外周血T淋巴细胞增殖情况，用ELISA试剂盒检测仔猪不同免疫时间段血清中PEDV抗体、沙门氏菌抗体、IL一4、IFN．Y细胞因子水平，以及仔猪粪便中IgA动态变化。检}Jn,U夕F周血淋巴细胞的增殖结果显示：在免疫第

8、42d后，微囊化重组沙门氏菌组与未微囊化重组菌、微囊化空载体菌、空载体菌和疫苗组差异不显著(P>0．05)。检测血清中PEDV抗体结果显示：整个免疫期间灭活疫苗组PEDV抗体水平显著高于微囊化重组菌组(P<0。05)，在免疫第42d后，微囊化重组菌组PEDV抗体水平显著高于未微囊化重组菌、微囊化空载体菌、空载体菌和对照组(P<0．05)。检测免疫仔猪血清中沙门氏菌抗体结果显示：在免疫第42d后，微囊化重组菌组沙门氏菌抗体水平显著高于疫苗组、未微囊化重组菌组、空载体菌组和对照组(p

9、菌组IgA抗体水平显著地持续高于灭活疫苗组、空载体组、微囊化空载体