[学位论文].表达大肠杆菌外膜蛋白抗原的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究

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4、f拧攒7n鸡大肠杆菌病(ChickenColibaciilosis)是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的传染病，感染该病会造成鸡体局部或全身性感染并引起一系列疾病最终导致死亡，该病已成为危害养禽业的重要疫病之一。鸡大肠杆菌病的防控和治疗以药物和疫苗为主，

5、抗菌药物仍是主要防治措施。但随着人们对抗菌药物越来越广泛的使用，大肠杆菌的耐药性、药物残留等问题日趋突出，近些年来，由于这些问题抗生素的使用遭到了广泛的置疑和反对。预防该病最有效的方法是接种疫苗，采取疫苗预防与合理用药相结合的措施是最为有效的方法。因此开发具有交叉保护的广谱疫苗是防控本病的重中之重。本研究选择减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R株为宿主菌，以asd基因作为营养缺陷标志，以编码大肠杆菌外膜蛋白的$632基因为外源基因，构建减毒鸡伤寒沙门氏菌染色体．质粒平衡致死系统表达大肠杆菌外膜蛋白抗原，以探讨

6、该重组口服疫苗对预防禽致病性大肠杆菌的保护效果。1．大肠杆菌外膜蛋白基因$632的克隆与原核表达本研究根据GenBank发表的大肠杆菌外膜蛋白的主要编码基因$632序列，采用DNAStar序列分析软件对比分析，针对$632设计一对引物。以江苏省42株疑似大肠杆菌的临床分离株为模板，PCR扩增目的片段$632，将目的片段克隆至pMDl9．Tsimplevector，而后转化大肠杆菌DH5a，经筛选鉴定后对其进行测序并对结果进行分析。发现其中有28株菌为大肠杆菌，测序结果表明，$632在大肠杆菌中普遍存

7、在且高度保守。将己构建的重组质粒pET-42a．$632转化BL21(DE3)进行诱导培养，当以终浓度为I．0mMIPTG诱导4h时表达量最高，检测到分子量大约为63KDa的目的蛋白。通过SDS—PAGE分析，该融合蛋白为包涵体，通过尿素变性、复性及镍柱亲和层析纯化的方法，最终获得浓度为0．964rag／m!的纯化融合蛋白，命名为pS632。该蛋白可作为包被抗原，为后续ELISA实验检测2．表达大肠杆菌共同外膜蛋白抗原的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌构建及免疫效果研究利用PCR技术扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白

8、的基因$632，将其插入含有asd基因的表达载体pYA3342中，构建重组表达载体pYA3342-S632，再将重组质粒电转化至已缺失编码天冬氨酸D一半醛脱氢酶的asd基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9Rzaasd突变株中，构建重组减毒鸡伤寒沙门氏菌活疫苗SG9R(pYA3342．$632)。并对重组菌的生长特性、口服安全性等生物学特性进行评定。将重组菌SG9R(pYA3342．$632)、SG9R(pYA3342)接种20优质论文4万方数据II扬州大学硕士学位论文集各组免疫鸡免疫后不同时间段血清，利用

9、间接ELISA法测定其体内特异性IgG抗体动态水平，首次免疫14d后，重组疫苗菌免疫组血清IgG抗体水平明显高于空载体对照组和PBS空白对照组(P0．05)。在二免两周后收集并制备气管粘膜液样品和肠粘膜液样品，利用间接ELISA法测定其体内特异性sIgA抗体水平，SG9R(pYA3342．S632)免疫组可在鸡的十二指肠粘膜中检测到特异性slgA抗体。免疫后，每组每周随机抽取3只试验鸡，分离外周血淋巴细胞，利用流式细胞术(

10、FCM)监测每组鸡外周血中CD3+和CD8+T淋巴细胞动态变化。结果显示，免疫后外周血中CD3+T细胞及CD8+T细胞含量均呈逐渐增加的趋势，各时期含量均高于PBS对照组，在二次免疫一周后达到较高水平随后保持平稳。用禽致病性大肠杆菌强毒株QD2(078：H54)分别对各实验组进行后胸气囊攻毒，观察10d内，重组疫苗菌免疫组、空载体对照组及空白对照组的死亡率分别为20．0％、70．0％和80．0％。用肠炎沙门氏菌50336菌株进行攻毒，PBS空白对照组的死亡率高达90％