两株携带猪流行性腹泻病毒s蛋白抗原区域的减毒沙门氏菌的构建与免疫规律研究

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1、万方数据S益Chua礁Ag盈：’iC醯盖．龟娃翦_a凑。iJniVersityDISSERTATl0NSubmittedinPaI·tialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEConstructionandimmunogenicityresearchoftwoimmunodominantregionofspikeproteinofporcinediarrheaviruspresentedbyattenuatedsalmonellatyphimuriumByLiangEntaoDirectedbyProf．H

2、uangXiaoboProf．何台nXintianProf．CaoSanjieYaan，SichuanMav20l4万方数据本研究受卞列基金项目资助特此表示感谢国家自然科学基金项目(项目编号：No．31072144)～It一舯．L11)1ltztH_lI]it!il!；删d00746}NationalNaturalScienceFoundationofChina(NNSFOC，PROJECTNo．31072144)万方数据论建独创经声胡本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外

3、，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生虢翠瑟硗勘ltf年f月《1日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。缸论文不保密。权。(请在

4、以上口内划“√’’)研究生签名：擎县暑导师签名：／啬七_蔓／一7’口本论文保密，在～年解密后适用本授加’q年‘月11日≯。擘年‘月11日一一螋址丛些厶望丝匕堂坦垒堑——⋯～一————万方数据摘要猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea、PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水和哺乳仔猪高致病率、高死亡率为主要特征的一种接触性肠道传染病，给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV的S蛋白是诱导产生保护性中和抗体的结构蛋白。本研究进行了S蛋白抗原区域的筛选，分别

5、构建了携带PEDVS蛋白主要抗原区域S一99-650和S499-789区域的重组减毒沙门氏菌疫苗，并以小鼠和仔猪为模型进行了口服免疫规律研究。1．S基因的两种真核表达载体的构建与鉴定根据GenBank中PEDVSC—L株S基因序列，设计特异性引物，采用RT-PCR技术扩增并克隆了S499—650、8499—789基因，并分别将S499．650、S499．789基因插入真核表达质粒pVAXl中，构建重组真核表达质粒pVAX—S499．650、pVAX一$499．789，然后转染COS一7细胞，通过间接免疫荧光及Western—blotting进行了蛋白表达

6、鉴定，重组真核表达质粒可在COS一7细胞中表达目的蛋白，表达的蛋白可与兔抗PEDV阳性血清发生特异性反应，证明真核表达载体构建成功。2．两株携带S基因的重组减毒沙门氏菌的构建及生物学特性研究将真核表达质粒pVAX．S499．650、pVAX．S499．789分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207，构建了重组减毒沙门氏菌菌株SL7207(pVAX．8499-650)、SL7207(pVAX。S499．789)。将这两株重组菌株分别以1×109CFU／只剂量口服免疫小鼠，对重组菌株在小鼠体内的稳定性、携带目的基因在体内的转录、小鼠体内的增殖、对小鼠的安全

7、性等菌株生物学特性进行研究。结果表明，SL7207(pVAX—S499-650)、SL7207(pVAX—S499-789)两株口服菌株均具有较高的稳定性；携带的目的基因可在肠道组织内转录；重组菌在小鼠肝、脾中增殖约5周后逐渐被机体清除；重组菌株对小鼠具有良好的安全性。本研究结果表明减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207可作为PEDVS基因不同抗原片段的呈递载体，为后续开展两种菌株的猪体口服免疫效果比较研究奠定了基础。3．重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性研究将15头仔猪，分成5组，分别以1×10妲CFU／头剂量口服免疫重组菌株——l型!l丛业厶望丝二：立堂焦论塞—

8、—一万方数据SL7207(pVAX一$499．650)一、SI，7207(pVA