单增李斯特菌δinlab、δinlabc突变株的构建及部分生物学特性研究

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1、VIConstructionandPartialBiologicalcharacteristicsofListeriamonocytogenesInlAB△，△InlABCmutantstrainsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByChenYunfei(VeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.JiangJianjunTaoYueJune，201

2、5XII摘要单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是重要的人畜共患传染病李斯特菌病的主要病原菌，人类和动物感染发病后主要表现为脑膜炎、胃肠道症状、败血症及孕畜（孕妇）流产等临床症状，发病死亡率可达到30%。该菌在自然环境中分布十分广泛，且具有较强的环境适应性，可在低温、高盐、酸碱等不利的环境条件下生长繁殖。LM作为胞内寄生致病菌可穿越宿主的肠道屏障、母婴胎盘屏障、血脑屏障，入侵宿主机体后能在吞噬细胞和非吞噬细胞内生长和繁殖。这些都与LM的内化素蛋白有直接的关系，内化素蛋白家族中的InlA、InlB为LM所特有，位于菌体表面，在LM黏附、侵袭宿主细胞的过

3、程中扮演着重要角色，其介导的侵袭细胞并内化至吞噬小体是LM建立感染的前提；InlC作为内化素家族中唯一的分泌型蛋白，在真核细胞表面未见有能与之相结合的受体，但在细菌感染的晚期，其表达量较高。这些重要的毒力因子对LM的毒力调控及生长代谢的影响，目前知之甚少。本研究以4b血清型中的食品分离株LM681及临床绵羊脑炎分离株LM90为亲本株，在LM681△InlA和LM90△InlA菌株基础上构建LM681△△InlAInlB、LM681△△InlAInlB△InlC和LM90△△InlAInlB菌株，通过比较亲本株与突变株及各突变株之间在小鼠致病性和体外生物学特性的差异，分析InlA、Inl

4、B、InlC毒力基因对LM的影响，为InlA、InlB、InlC的进一步研究提供条件和奠定基础。主要研究内容和结果如下：1、LM681△InlAB、LM681△InlABC、LM90△InlAB突变株的构建与鉴定：以LM681和LM90菌株的基因组为模板，扩增InlB基因和InlC基因的上下游同源臂，使用同源重组的方法构建内化素基因缺失株；最终成功构建LM681I△nlAB、LM90△InlAB、LM681△InlABC突变株。2、InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失对LM毒力的影响：亲本株LM681和各突变株LM681△InlA、LM681△InlB、LM681△InlAB、L

5、M681△InlABC在同等条件下培养后：1）小白鼠腹腔接种菌液，饲养观察10d，统计死亡率测定LD50；2）小白鼠腹腔接种菌液后，24h、48h、72h每个时间段无菌摘取小白鼠肝脏、脾脏、脑组织，CFU计数，统计各组织的载菌量；3）各菌株划线接种于7%绵羊血BHI平板培养基上，37℃条件下培养24h，观察各菌株溶血情况。试验结果：与亲本株LM681相比，LM681△InlABC的毒力降低了3个数量级，LM681△InlAB的毒力降低了2个数量级，LM681△InlA和LM681△InlB的毒力均下降1个数量级；各突变株的肝脏、脾脏、脑组织载菌量减少；亲本株LM681和各突变株的在7%

6、绵羊血BHI培养基上均呈β溶血。结果表明：InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失能降低LM的致病性；InlB的缺失降低了LM在肝脏和脑组织中的载菌量，InlA的缺失降低了LM在脾脏中的增殖，InlC能够协同InlA和InlB介导LM在肝脏、脾脏和脑组织中的增殖；InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失不影响LM的溶血性。3、InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失对LM体外生物学特性的影响：I通过测定亲本株LM681和各突变株LM681△InlA、LM681△InlB、LM681△InlAB、LM681△InlABC在37℃条件下不同pH值BHI培养基中的生长浓度，比对InlA

7、、InlB、InlC毒力基因的缺失对LM体外生长能力及酸碱耐受性的影响；同等条件下通过生化反应实验，比对InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失对LM代谢能力的影响；通过对15种临床常用敏感药物的耐药性检测，比对InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失对LM药物敏感性的影响。结果显示：InlA、InlB、InlC毒力基因的缺失均能降低LM的体外生长能力，但不影响LM的耐酸耐碱性，不影响LM的代谢能力，不改变LM对药物的敏感性。所有以上结果表