单增李斯特菌表面蛋白基因lmo0159、lmo0160缺失株的构建及部分生物学特性研究.pdf

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1、分类号：密级：1学号：2015201717单位代码：10759石河子大学硕士学位论文单增李斯特菌表面蛋白基因lmo0159、lmo0160缺失株的构建及部分生物学特性研究学位申请人张奇文指导教师马勋教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月2ConstructionandCharacterizationoflmo0159andlmo0160GenesDeletionstrainsofListeriamonocytogenesADissertationSubmittedtoShiheziUnive

2、rsityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasaterofAgricultureByZhangQi-wen(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.MaXunJune,20183I课题来源项目来源：国家自然基金项目项目名称：基于单核细胞增多性李斯特菌分选酶SrtA的蛋白组学和免疫蛋白组学研究项目编号：31360614全文摘要单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes,LM），是一种食源性致病菌，在自然界中广泛存在，常通过污染的

3、食物感染人和动物。该菌为胞内寄生菌，可穿越宿主血脑屏障，肠道屏障及胎盘屏障，临床上引起腹泻、脑膜脑炎、败血症、新生儿溶血、肝炎及流产等症状，发病率及死亡率较高。LM细胞壁表面存在多种毒力蛋白，其中有一类至关重要的表面蛋白，其C-末端区含有LPXTG（Leu-Pro-X-Thr-Gly）保守基序，由分选酶SortA识别共价结合到细胞壁肽聚糖上，呈现在细胞表面，发挥其毒力作用。根据LMEGD-e参考菌株的全基因组序列预测有41种LPXTG基序蛋白，其中Lmo0159和Lmo0160功能未知，本研究以李斯特菌病绵羊脑分离株LM90SB2为研究对象，对lmo0159、lmo0160基因进行克

4、隆及生物信息学分析；利用同源重组技术分别构建LM90SB2-lmo0159和LM90SB2-lmo0160基因缺失株，分析其在环境耐受性、生物被膜形成能力及细胞水平和动物机体毒力的差异，以探讨lmo0159和lmo0160基因的功能，为进一步研究LM的致病机理奠定了基础。主要研究内容和结果如下：1.LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因克隆及序列分析：为了了解LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因编码蛋白的特征，利用PCR方法扩增lmo0159、lmo0160基因，分别连接pMD19-T载体，测序分析其特征。结果显示：lmo0159序列全长2070bp

5、，编码617个氨基酸；lmo0160序列全长为1708bp，编码475个氨基酸；lmo0159、lmo0160基因核苷酸序列分别与不同来源4b型LM同源性均高达99%以上。Lmo0159蛋白是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白；Lmo0160蛋白为疏水性蛋白。两种蛋白均含有胶原蛋白结合域和CnaB功能域。本研究成功克隆LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因，并初步预测分析了目的基因部分生物学特征，为进一步研究LM90SB2菌株lmo0159、lmo0160基因功能提供了理论依据。2.LM90SB2-lmo0159、LM90SB2-lmo0160缺失株的构建及鉴定：为研究l

6、mo0159、lmo0160基因的功能，本试验利用PCR技术分别扩增lmo0159、lmo0160基因的上下游同源臂，SOE-PCR方法进行同源臂融合，获得lmo0159、lmo0160缺失片段，分别连接到pMD19-T载体，获得pMD19-T-lmo0159、pMD19-T-lmo0160，测序成功后，经双酶切并连接至pKSV7，获得重组穿梭质粒pKSV7-lmo0159和pKSV7-lmo0160，分别电转化到LM90SB2感受态细胞中，获得阳性转化子，置于含10μg/mL氯霉素BHI培养基中，42℃传代培养，获得LM90SB2-lmo0159和LM90SB2-l

7、mo0160基因缺失株。再置37℃无抗性BHI培养基传代培养30代，PCR检测遗传稳定性，结果显示LM90SB2-lmo0159和LM90SB2-lmo0160基因缺失株构建成功，且遗传稳定。3.LM90SB2-lmo0159、LM90SB2-lmo0160缺失株环境适应性和生物被膜形成能力的研究：为探讨lmo0159和lmo0160基因缺失对LM环境适应性和生物被膜形成能力的影响。本试验测定了不同温度、pH、NaCl、乙醇胁迫环境下细菌生长情况及