单增李斯特菌Lmo0331蛋白基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究.pdf

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1、分类号：密级：学号：2015201708单位代码：10759石河子大学硕士学位论文单增李斯特菌Lmo0331蛋白基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究学位申请人杜冬冬指导教师马勋教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国新疆石河子2018年6月ConstructionandsomeBiologicalcharacteristicsoflmo0331genedeletionmutantstrainofListeriamonocytogenesADi

2、ssertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByDuDongdong(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.MaXunJune,2018全文摘要单核细胞增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是重要的人兽共患食源性病原菌，对人和多种动物的

3、健康威胁较大。LM能在多种毒力因子作用下，穿越宿主的肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障，从而引起败血症、脑膜炎、流产等疾病，死亡率高达30%。LPXTG基序表面蛋白在LM感染细胞过程中发挥重要作用。Lmo0331蛋白是根据LM全基因组序列推测的LPXTG基序表面蛋白，但是其功能尚不清楚。本研究以绵羊李斯特菌病的脑组织分离株LM90SB2（血清型4b）为研究对象，首先对LM90SB2的lmo0331基因进行序列分析及原核表达；利用同源重组技术构建LM90SB2的lmo0331基因缺失株，与亲本株比较，对不同细胞粘附

4、侵袭能力、小鼠的致病性、环境适应性等生物学特性，初步探究lmo0331基因的功能。为进一步研究LM的致病机制奠定基础。1.LM90SB2lmo0331基因分析和原核表达为了对单增李斯特菌临床分离株LM90SB2的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、蛋白质结构域分析和原核表达。根据GenBank中收录的lmo0331基因序列设计特异性引物，利用PCR方法扩增LM90SB2lmo0331基因，将扩增产物克隆到pMD19-T载体，测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析；构建表达质粒pET32a-033

5、1，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE和Westernblotting检测重组蛋白。结果显示，LM90SB2lmo0331基因核酸序列与NTSN株(4b型，绵羊脑，中国江苏)、F2365株（4b型，奶酪，美国）、LL195株（4b型，瑞士）及WSLC1033株的同源性为100.0%，与N2306株(4b，李斯特菌病人的血液，瑞士)、02-1792株（4b，加拿大，奶酪）、H34株的同源性为99.9%。分离株LM90SB2的lmo0331基因全长1956bp，OR

6、F全长为1857bp，共编码618个氨基酸；蛋白结构域预测结果显示，Lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带，Westernblotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。2.LM90SB2△lmo0331缺失株的构建为了构建LM90SB2△lmo0331缺失株，PCR扩增LM90SB2lmo0331基因的上下游臂，通过重叠PCR技术将lmo0331基因的上下游臂融合扩增得到△lmo0331基因片段，将△lm

7、o0331基因片段与自杀性质粒pKSV7连接。将重组质粒pKSV7-△lmo0331电转化到LM90SB2感受态中，PCR筛选阳性转化子。获得的阳性转化子置于含氯霉素的BHI培养基中41℃传代培养，在双重压力下实现同源重组，旁侧引物检测重组情况。重组完全的菌株置于30℃无抗性培养基中连续传代，丢失pKSV7穿梭质粒，并检测其稳定性。通过PCR和测序结果显示表明lmo0331基因编码区被完全删除，且缺失株具有良好的遗传稳定性。3.lmo0331基因缺失对LM90SB2体外环境耐受性影响为了探究lmo0331基

8、因对LM环境适应性的影响，比较了LM90SB2△lmo0331和LM90SB2在不同温度、pH、渗透压下生长特性、生物被膜形成能力等差异。结果显示：I在4℃环境下，LM90SB△lmo0331缺失株的生长速度显著高于LM90SB2野毒株(P<0.05)；体外耐酸耐碱试验中，在碱性环境中（pH=9）LM90SB2△lmo0331缺失株生长能力低于亲本株LM90SB2(P<0.05)；在含4.5%乙醇的BHI培养基中