肠炎沙门氏菌三种主要毒力岛基因缺失株的构建及其免疫效力研究

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1、Universitycode：10223Classifiedcode：S855.1+2Graduatenumber：XS1233080Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationConstructionofthreemajorpathogenicityislandsdeleted-mutantsofSalmonellaentericaserovarEnteritidisandevaluationoftheirimmuneefficacyinchickensPostgrad

2、uate：LvXue-lianProfessorLiuSi-guoSupervisor：ProfessorNiHong-boMajor：PreventiveVererinaryMedicineResearchdirection：MolecularImmunologyCollegeofAnimalScience＆College：VeterinaryMedicineDaqingChinaJune.2015摘要肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis,SE）属于革兰氏阴性菌，兼性胞内病原菌，主要感染禽类。沙门氏菌病属于重要的食源性致病菌之一，经常通过污染的水和食物引起人类疾病。

3、沙门氏菌的致病性与其包含的毒力基因密切相关，其毒力基因主要位于染色体和质粒上，这些毒力相关基因和调节子都位于染色体的特殊区域，被称作毒力岛。然而，关于这些毒力岛基因是如何影响沙门氏菌感染鸡的信息还较为有限。因此，构建沙门氏菌单个或多个毒力岛的基因缺失株，并评估这些毒力岛对沙门氏菌致病性的影响以及在鸡体内诱导免疫应答变化是非常重要的。本实验利用改进的、可以敲除大片段基因（>40Kb）的Red同源重组系统，以沙门氏菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增毒力岛(SPI-1、SPI-2、SPI-3)的上下游同源臂，同时扩增pKD3质粒中氯霉素抗性基因的DNA片段，一起连接到pET28a载体中构

4、建打靶质粒，采用电击转化方法将其转入含有pKD46a质粒的肠炎沙门菌中，经L-阿拉伯糖诱导同源重组后，鉴定阳性重组子，转化诱导产生重组酶FLP的pCP20质粒，从而删除氯霉素抗性基因。通过PCR方法鉴定三种主要毒力岛的单缺失、双缺失及三缺失菌株并命名为SM6ΔSPI-1、SM6ΔSPI-2、SM6ΔSPI-3、SM6ΔSPI-1&2、SM6ΔSPI-1&3、SM6ΔSPI-2&3、SM6ΔSPI-1-3。经体外连续传代培养的方法表明这些缺失株都具有良好的遗传稳定性；在生长特性方面，除SM6ΔSPI-2&3以外，其它缺失株的生长速率均高于野生菌株；经扫描电镜观察，除SM6ΔSPI-2&3以

5、外，其它缺失株均呈现不同程度的细菌间粘连；缺失株和野生株在碳源代谢上有一定的差异；敲除SPI-1后的单缺失、双缺失和三缺失菌株的侵袭力均下降，而其他缺失菌株和野生菌株相比侵袭能力差别不大；所有缺失株对细胞的粘附力均显著低于野生菌株(P<0.001)。将上述毒力岛缺失株分别接种7日龄SPF鸡，评价缺失株的致病力、定殖能力以及对鸡只的免疫效力。结果表明，毒力岛缺失菌株可以在肝脏、脾脏和盲肠中定殖，但不会引起鸡只发病，且SM6ΔSPI-1-3在脾脏和肝脏中的定殖效率低于SM6，接种第8天即被机体迅速清除；应用沙门氏菌全菌体作为包被抗原，间接ELISA的方法检测血清中的IgG，结++果表明减毒菌

6、株产生的抗体均处于较高水平；应用流式细胞仪检测CD4T和CD8T亚群，++结果显示毒力岛缺失菌株免疫后机体CD4T和CD8T亚群的均有明显变化。免疫后检测血清中IL-4和IFN-γ的细胞因子水平也有上升趋势，并且病理学结果表明鸡只无明显的病理改变。上述结果证明，毒力岛缺失菌株中SM6ΔSPI-1-3有较好的免疫效果及保护效率。I三种主要毒力岛缺失菌株的成功构建为阐明肠炎沙门氏菌致病机制和研发安全有效的减毒活疫苗奠定了良好的基础，也为预防和治疗沙门氏菌病提供了一个新的视野。关键词：肠炎沙门氏菌，Red同源重组，毒力岛，弱毒活疫苗IIAbstractTheGram-negativebacte

7、riaSalmonellaenterica,afacultativeintracellularpathogen,mainlyinfectbirds.Salmonellosis,themostfrequentfood-bornediseaseinhumans,usuallyresultsfromcontaminatedwaterandfood.VirulencegenesofSalmonellathatcorrelatewithpat