sigmab基因缺失对单核细胞增生李斯特菌致病性和环境应激能力的影响

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1、分类号：密级：学号：2010108043单位代码：10759石河子大学硕士学位论文SigmaB基因缺失对单核细胞增生李斯特菌致病性和环境应激能力的影响学位申请人杨丽红指导教师乔军教授申请学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月TheeffectsofSigmaBgenedeletiononpathogenicandenvironmentalstressabilityofListeriamonocytogenesADisse

2、rtationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByYangLi-hong(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.QiaojunJune,2013课题来源1.国家自然科学基金资助项目（NO：30960276）；项目名称：prfA基因突变对单核细胞增生李斯特菌毒力和

3、免疫原性的影响。2.家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放课题资助项目（NO：KEYLAB200906）；项目名称：单核细胞增生李斯特菌LIPI-1毒力岛的基因改造及重组菌生物学特性研究。3.石河子大学高层次人才专项（NO：RCZX200801）；项目名称：单核细胞增生李斯特菌LIPI-1毒力岛的基因改造研究。中文摘要单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性致病菌，生存能力强，存在范围广。LM主要通过消化道引起动物和人的急性感染，对畜牧业

4、和人类健康造成了巨大的威胁，因此，LM被世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）列为四大食源性致病菌之一。作为一种典型的细胞内寄生致病菌，LM能在专业和非专业吞噬细胞内生长繁殖，可刺激机体产生特异性的细胞免疫，因而许多研究者希望通过改造LM的毒力基因，使其毒力降低，用作LM弱毒疫苗或抗病毒、抗肿瘤的疫苗活载体。然而，作为疫苗或疫苗活载体，必须要安全可靠。尽管国内外学者对LM部分毒力基因进行了改造，但未获得预期的减毒效果。在LM中，σB因子由SigmaB基因编码，是RN

5、A聚合酶全酶中的一个亚基，研究表明σB因子对许多毒力基因的转录具有调节作用，因此本研究通过基因缺失手段构建SigmaB基因缺失株，为LM弱毒疫苗和疫苗活载体研发奠定理论基础。研究方法和主要结果如下：1.LM新疆野毒株XS5SigmaB操纵子的克隆及序列分析根据GenBank登录的SigmaB操纵子序列，设计引物，PCR扩增LM新疆野毒株XS5SigmaB操纵子基因片段，用DNAMAN软件和在线软件分析扩增序列所含各基因编码蛋白的活性位点和高级结构。结果成功扩增出3000bp的SigmaB操纵子片段

6、，该序列含有rsbV、rsbW、rsbX和SigmaB四个基因，其中SigmaB基因全长801bp，编码265个氨基酸，8到264位AA为RNA聚合酶全酶中的σB因子区域，41到110位AA为Sigma70_r2超家族，是整个蛋白质中最保守的区域。SigmaB基因同源性分析显示，在LM不同菌株之间SigmaB基因的同源性较高，表明该基因具有较高的保守性。2.LM-XS5-△SigmaB缺失株的构建与分子鉴定根据实验一获得的SigmaB操纵子测序结果设计融合PCR引物，运用重叠延伸PCR技术获得缺失

7、SigmaB基因的融合PCR产物，构建重组质粒pMD19-T-ΔSigmaB，测序。构建重组穿梭载体pKSV7-ΔSigmaB。用电击转化的方法将重组穿梭载体转入LM-XS5感受态细胞，用PCR方法筛选和鉴定重组菌。结果成功构建了SigmaB基因缺失株（LM-XS5-△SigmaB）。重组缺失株PCR鉴定条带与预期缺失后的值1502bp相符，测序结果证实成功缺失了LM-XS5的SigmaB基因。经过25代的连续传代，PCR鉴定结果显示，该缺失株具有良好的遗传稳定性。3.SigmaB基因缺失对LM致

8、病性和环境应激能力的影响将野毒株LM-XS5和实验二构建的SigmaB基因缺株LM-XS5-△SigmaB于相同条件下培养后，分别感染巨噬细胞RAW264.7和BALB/C小鼠，通过单菌落计数、存活小鼠的统计以及Real-timeRT-PCR毒力基因表达量检测的方法来对比缺失株与野毒株的致病性差异。实验结果显示，与野毒株相比，SigmaB基因缺株的粘附率和侵袭率均下降（p<0.05）；肝、脾载菌量减少（p<0.05）；LD50升高了2.60个对数数量级；被检测的I毒力基因表达量均降