单核细胞增生李斯特菌hlya基因实时荧光pcr的建立与研究

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1、单核细胞增生李斯特菌hlyA基因实时荧光PCR的建立与研究林艳艳邢子伟谭翰清肇庆市医学高等专科学校肇庆市疾病预防控制中心摘要：口的建立单核细胞增生李斯特菌hlyA基因TaqMan探针实时荧光PCR,用于食品卫生检验的快速筛查。方法根据单核细胞增生李斯特菌hlyA基因设计特异的引物与TaqMan探针，建立和优化实时荧光PCR反应体系，评估其特界性、灵敏度、稳定性，并在食品卫牛检验中与细菌分离方法同步应用比较。结果建立了单核细胞增生李斯特菌TaqMan探针实时荧光PCR反应体系，经优化其最佳退火/延伸的温度为58°C,25uL反应体系屮上、下游引物和探针最佳终浓度配比分别为0.7、0.7、0.

2、4umol/L;该实时荧光PCR反应体系可在35min内完成检测,与沙门菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌等16种非目标菌无交叉反应，对阳性克隆质粒的检测下限可达100拷贝/卩L的稀释梯度，对同一核酸浓度样木20次检测的CL值变异系数为0.46%;在对120份食品安全风险监测标本的快速检测应用屮，6份标本单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR扩增阳性，从相应样本屮分离出6株单核细胞增生李斯特菌，实时荧光PCR与分离培养方法检测结果相一致。结论针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因建立的TaqMan探针实时荧光PCR具有快速、特异、灵敏、稳定等优势，可用于食品卫生检验中单核细胞增生李斯特菌的快速、高

3、效筛查。关键词：单核细胞增生性李斯特菌;实时荧光PCR;溶血素基因;作者简介：林艳艳(1985—),女，本科，检验师，研究方向:微生物实验与教作者简介：邢子伟，E-mail:2381820@qq.com收稿日期：2017-04-25基金：肇庆市科技创新计划项目(No.2013E1810)Establishmentandapplicationofreal-timePCRforhlyAgeneofListeriamonocytogenesLINYanyanXINGZiweiTANHanqingZhaoqingMedicalCollege;Abstract：ObjectiveToestablis

4、haTaqManprobe-basedreal-timePCRforhlyAgeneofListeriamonocytogenesandapplyitinfoodhygieneinspection.MethodsBasedontheconservativesequenceofhemolysingeneAofL.monocytogenes,thespecificprimersandTaqManprobe-basedprobeweredesignedtoestablishareal-timePCRassay.Theoptimizationandassessmcntforthespecifici

5、ty,sensitivity,andstabilityofthereal-timePCRassaywereconductedandappliedinfoodhygieneinspectionbycontrastwiththebacteriaisolationmethod.ResultsTheTaqManprobe-basedreal-timePCRassayforL-monocytogeneswasestablished.Afteroptimizationtests,theoptimumannealing/extensiontcmpcratureforthereal-timePCRwas5

6、8°C,andtheoptimumconcentrationratiofortheupstreamanddownstreamprimersandtheprobein25P1reactionvolumewere0.7pmol/L,0.7umol/Land0.4umol/L,respectively.Thereal-timePCRassaycouldfinishatestin35minutes,andtherewasnocrossingreactionwiththeother16strainsofnon-targctcdbacteriasuchasSalmonella,L.iuanuii,L.

7、innocua,etal.Thelowestdetectionlimitforthedss^ycouldreachthedilutionof100copiesofrecombinantplasmidspermicrolitre.ThecoefficientofvariationforCtvaluetestedintwentytimesforthesameconcentrationofnucleicacidwas0.46%