单核细胞增生李斯特氏菌pcr检测方法

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1、选墼单核细胞增生李斯特氏菌的PCR检测方法徐宝梁贾建会陈颖赵贵明苏宁吴亚君1(中国进出【1]商品检验技术研究所，北京，100025)2(北京市食品研究所，北京，100076)摘要研究比较了裂解法、热煮沸法、试验盒法提取单增李斯特氏菌DNA的效果，认为Promega试剂盒法提取的DNA，得率高、纯度好。同时根据单增李斯特氏茵的毒力相关基因的5对引物，进行了引物的特异性研究，结果发现in[A引物、intB引物、picA引物特异性好，可以用于食品中单增李斯特氏菌的检测。关键词单核细胞增生李斯特氏菌，聚合酶链式反应(PCR)

2、，检测方法单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamono—李斯特氏菌(L．innocua)菌株、绵羊李斯特氏cytogenes，简称单增李斯特氏菌)，能引起人畜菌(L．ivanovii)菌株、大肠埃希氏菌(Es—共患疾病，是食品卫生上的重要病原菌⋯。根cherichiacoli)菌株、蜡样芽孢杆菌(Bacillus据wHo的报道，乳制品的污染率为5％～cereus)菌株、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaty—10％，肉及制品的污染为30％，家禽的污染为phimurium)菌株、金黄色葡萄球菌(Staphylic

3、—15％，水产品的污染为4％～8％。该菌主要感OCCUSaureus)菌株，由中国药品生物制品检定所染老年人、小孩和免疫缺陷个体，可导致脑膜提供。炎、脑炎、败血症等，病死率较高，达25％～1．1．2试剂30％l。近年来，一些国家和地区爆发了数起引物(上海生工)，WizardGenomicDNA由该菌引起的食物中毒。该菌能在低温下purificationkit(Promega)，SDS(十二烷基磺酸(4"C)生长_3j，因此在普通冰箱中该菌仍能繁钠)(Sigma)，Taq酶(道普)，dNTPs(Promega)，殖，并

4、可发生交叉污染。随着我国冷藏、速冻食PCR缓冲液(道普)，溴化乙锭(Sigma)，分子质品消费量的迅速增多，食品中单增李斯特氏菌量Marker(100～600bp)(鼎国)，0．5xTBE(鼎的潜在危险性也越来越大。应用常规方法检验国)，琼脂糖(电泳纯)(Blowest)，无水乙醇(AP)耗时费力，程序复杂_4j。采用聚合酶链反应(北京化工厂)，cch(AP)(北京化工厂)，异丙(PCR)法检测，4h内可完成检测过程，大大缩醇(AP)(北京化工厂)，NaOH(AP)(北京化工短了检测时问。PCR检测方法的技术关键是厂

5、)，胰蛋白胨大豆肉汤(陆桥)，胰酪胨大豆酵引物设计和引物的特异性确定，研究中，采用了母浸膏肉汤(陆桥)，胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂扩增单增李斯特氏菌毒力相磁编码基因的5对(陆桥)，碱裂解液(0．5mol／LNaOH，2．5％引物_6』，并对这些引物进行了特异性研究。SDS)。1．1．3主要仪器设备1材料与方法冷冻离心机(5804R、Eppendorf)，核酸与蛋1．1材料白质分析仪(DU640型、Beckmancoulter)，Ge—1．1．1菌种来源neAMPPCR(System9700、ABI)，凝胶电泳仪单核细胞增

6、生李斯特氏菌(Listeriamono—(CW—U型、北京六一厂)，凝胶成像仪(Genecytogenes)菌株，由加拿大卫生部提供；英诺克Genius、SYNGENE)。第一作者：硕士，高级工程师。*科技部社会公益型重点项目“影响食物安全的生物种类基因鉴别技术研究”内容(No．202DIA50034)收稿时间：2004211(100)1．2方法个循环，(3)72℃延伸7min1．2．1茵种培养以单增李斯特氏菌为阳性对照空白对照配制胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤⋯、胰蛋白不加任何DNA模板胨大豆肉汤l6】。在胰酪胨大豆酵母浸

7、膏肉汤1．2．3．3电泳检测中接种单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、绵2％琼脂糖，溴化乙锭终浓度为1~tg／mL。羊李斯特氏菌；在胰蛋白胨大豆肉汤中接种大将5～8LPCR扩增产物或t0倍稀释后的总脑埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、DNA分别和适量加样缓冲液混合，点样。9V／金黄色葡萄球菌36℃培养24hcm恒压，电泳2O～30min。紫外检测仪下观察1．2．2DNA的提取电泳结果并记录1．2．2．1裂解法2结果与分析摇匀，吸取1000L培养液，加入含有200L碱裂解液的1．5mL微量离心管中，置于沸2．1DN

8、A提取方法水中15min；于4℃冰箱过夜，15℃、13000r／应用不同方法提取的单增李斯特氏菌总rain离心3min；取上清液，备用。DNA，经1O倍稀释后，电泳检测，结果见图1。1．2．2．2热煮沸法用试剂盒提取的总DNA，可见到清晰的电泳条同1．2．2．1，但不加碱裂解渡。带；而其他2种方法提取的总DNA，难以见到1．2．2．3试剂盒法电