基于活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立

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1、华中农业大学博士学位论文基于活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立姓名：龙飞申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：史贤明;张忠明20080901基丁．活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立扩增效率，结果表明活菌内标与野生菌在109cfu．105cfu的范围内其DNA提取效率是相似的(约10％)，同时两者具有相似的PCR扩增效率(野生菌1．05、活菌内标1．06)。(2)建立了根据活菌内标数量计算DNA提取前野生菌体量的线性回归方程Y=．0．313x．0．0773，回归方程的相关

2、系数R=0．9997，结果表明，根据该线性回归方程计算所得的DNA提取前野生菌菌体量与实际菌体含量基本一致，而由传统标准曲线法计算得到的菌体量要比实际量少一个数量级。5、全程指示假阴性的荧光定量PCR检测体系(LM．IACEQ．PCRassay)的建立：(1)运用BIOLOG系统、VITEK系统比较了野生菌和活菌内标的生化特性，结果表明野生菌与活菌内标对检测板上的各项生化物质利用能力基本一致。(2)通过均匀设计试验评价了不同活菌内标加入量对野生菌在增菌培养中的影响，结果表明102cfu．104cfu的活菌内标接种

3、量不影响野生菌的生长，其生长代时分别为49min(野生菌)和55min(活菌内标)。(3)将103cfu数量级的野生菌与活菌内标分别接入牛奶、鸡肉和腌肉样品，用UVM选择性增菌液培养，并以不添加食品样品的UVM纯培养为阳性对照，分别取增菌0h、3h、6h的样品进行荧光PCR检测，结果表明阳性对照和牛奶样品中的野生菌和活菌内标不经过增菌培养即可检出，鸡肉样品经增菌3h后野生菌和活菌内标方可检出，而腌肉样品要经增菌6h后才可检出野生菌和活菌内标。这说明本研究建立的检测体系能够指示鸡肉和腌肉样品检测中的假阴性现象，有助

4、于提高检测的准确率，同时可有效减少增菌时间。6、可用于单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌普通PCR检测的多重扩增内标(multipleintemalamplificationcontrol，mIAC)检测体系的建立：针对单核细胞增生李斯特菌^们基因、沙门氏菌拥倒基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物，根据这3对引物序列运用重叠PCR技术人工合成了l条多重扩增内标，可分别用于单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的普通PCR检测。含多重扩增内标的PCR检测体系的DNA检测灵敏度分别为：单核细胞增

5、生李斯特菌，73．O彰“l；沙门氏菌，5．04彰¨l和副溶血弧菌，76．4彰“l。通过对40份鸡肉、60份牛奶和60份虾样品分别进行单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的人工污染试验，结果显示鸡肉样品有2份出现假阴性、牛奶样品有2份出现假阴性、虾样品有3份出现假阴性，说明本研究建立的检测体系在进行大量样品检测时能够有效指示假阴性，有助于提高检测的准确率，并降低检测成本。关键词：单核细胞增生李斯特菌：荧光定量PCR；DNA随机改组；活菌内标；假阴性II华中农业人学2008届博士-学位论文AbstractLis

6、teriamonocytogenesisanimportantfood—bornepathogenthatcauseslisteriosis．Itiswidelydistributedintheenvironment，anditsinfectionscanbelifethreatening，withahighfatalityrateof20to30％．Itwasestimatedthatapproximately2．500individualshavedevelopedlisteriosisintheUnited

7、Statesperyearandthecostsoftheacuteillness舫mfoodbomeListeriaare$2．3billion．Atthesametime．L．monocytogeneshasemergedasasignificantfoodbornepathogeninChinaduringthepastfewyears，alongwithatrendtowardincreasingconsumptionofready-to-eatfoodproducts．Therefore．rapidde

8、tectionmethodsareofsignificantimportancetotheL．monocytogenesqualitycontrolprograms，whichhavetobeappliedthroughoutthefoodproductionchain．InordertoovercomethelimitationsoftraditionalPCRmeth